悦读系列：限制性内切酶在重组DNA技术中的应用

2023-02-10

寡核苷酸

限制性内切酶也被称为分子剪刀。限制性内切酶识别DNA中核苷酸的特定序列，并在这些位点或更随机地将DNA剪切成片段。这些被DNA中的酶识别的核苷酸的特定序列被称为限制性位点。这些位点对特异性限制性内切酶具有特异性。酶通过磷酸二酯键的水解切断DNA的两条链。在这些酶被发现之前，没有已知的方法来剪切离散特定位点的DNA。限制性内切酶在DNA操作中的应用很快被认识到。这种限制性内切酶存在于许多细菌和古细菌中，迄今为止已成功分离出几种，并用于DNA操作。1 引言在二十世纪早期，人们发现一些被称为噬菌体的病毒以宿主特异性方式感染细菌。这些病毒将它们的DNA导入细菌，利用宿主细胞机制繁殖，然后离开宿主细胞，导致宿主死亡。在自然界中，限制修饰系统作为一种防御机制在古细菌和细菌中进化而来，以对抗病毒感染。使用这个系统，细菌可以监测进入的DNA，如果DNA被识别为外来的，就可以破坏病毒。1960年对限制修改的详细机制进行了解释。限制修饰系统涉及细菌分泌两种特殊酶一核酸内切酶（也被称为限制性内切酶）和甲基化酶。核酸内切酶识别病毒基因组中的特定序列，并将其切割以保护宿主免受病毒的攻击。细菌通过宿主修饰系统中的第二种酶即甲基化酶，催化特定腺嘌呤或胞嘧啶碱基甲基化，从而修饰自身的DNA，从而保护自身免受这些核酸内切酶的侵害。关于限制和修饰机制的信息表明，细菌系统不仅限制了病毒的感染率，而且可以允许具有相同限制和修饰系统的细菌之间的遗传信息交换。1970年，Werner Arber，Daniel Nathans和Hamilton O. Smith因发现和鉴定第一个限制性内切酶HindII而被授予1978年诺贝尔生理学和医学奖。HindII发现后，许多其他限制性内切酶被分离鉴定。这进一步推动了DNA操作和重组DNA技术的发展。限制性内切酶的命名方法是由Smith和Nathans在1973年提出的。根据他们的提议，酶的名称以斜体字的三个字母首字母缩略词开头，第一个字母代表从中分离出酶的细菌属，接下来的两个字母代表细菌种类，名字后面也可以加上额外的字母或数字来表示血清型或菌株，后面跟一个空格，然后是一个用罗马数字写的数字，表示识别的时间顺序。例如，在酶BamHI中，Bam代表Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌），它是从细菌中分离出来的，“H”代表菌株H，“I”代表从该种中分离出来的第一种酶。2 根据酶的特性进行分类限制性内切酶在其结构、独特的裂解位点以及其作用所需的辅助因子上有很大的差异。基于这些标准，将这些酶分为4种类型(表1)。限制性内切酶除了在DNA操作方面具有重要作用外，还被证明是研究高度特异的蛋白质-核酸相互作用、结构-功能关系以及了解这些酶如何进化的优良系统。表1 不同类别的限制性内切酶2.1 I型酶Ⅰ型酶由5个亚基组成。该活性酶由两个限制性亚基(2R)、两个甲基化修饰DNA亚基(2M)和一个识别亚基(S)组成。它们同时具有甲基化酶和核酸内切酶活性。这些酶的活性需要ATP、镁离子和S-腺苷甲硫氨酸。I型酶识别两组被间隔隔开的序列。S亚基由一对目标识别序列组成，每个序列识别一半序列。目标识别序列之间的重组可以在体内产生新的序列特异性，是I型R-M系统多样化的原因。根据Ⅰ型酶的氨基酸序列、抗体反应性和互补性试验，将Ⅰ型酶进一步分为5组。当用这些酶处理的核酸进行电泳时，不会形成不同的限制性片段或不同的条带模式。这一类酶的实用价值较低。2.2 II型酶将限制性内切酶分类为II型是基于酶在识别位点内或附近特异性切割的性质。这个过程不需要ATP。II型广泛用于基因操作。II型酶的识别序列如表2所示。典型的II型酶能够特异性识别4核苷酸或8核苷酸的旋转对称核酸序列(又称回文序列)，在该序列内或与该序列相邻切割，以生成5'-磷酸和3'-OH末端，需要Mg2+离子的存在。催化活性会产生钝端或带有悬垂的粘端。当限制性内切酶以直线切割双链DNA以生成3个主要游离羟基和5个主要磷酸基团时，会形成钝端。示例: PvuII [CAG * CTG]粘性末端以小的单链形式产生，它们可以与另一个DNA的互补碱基连接或自结扎。悬垂可以在5 ′-磷酸盐或3 ′-羟基末端示例：PSTI产生3'-OH悬垂[CTGCA*G]ECORI生成5'-磷酸盐悬垂[G*AATTC]II型酶的亚类：有些II型核酸内切酶不显示基本性质，并被进一步分类为亚型，如下所示。IIS型：这类II型酶识别不对称的序列，并以一定的距离切割这些序列。表2 II型酶的识别序列*表示切割或连接位点• 5'-GGATG-3'位点被酶识别激活其切割结构域。结果，它在识别序列上游的第一链9个核苷酸和下游的第二链13个核苷酸的位置切割。• IIE型：这种亚型在两个方面识别并与它们的识别序列相互作用--一个裂解靶和一个变构效应物。例如Naei。• IIF型：这些类似于IIE型酶，需要与其识别序列的两个部分相互作用。它们不同于IIE型酶，因为它们在协同反应中切割两个序列。IIF型：这些类似于IIE型酶，需要与它们识别序列的两个部分相互作用。它们不同于IIE型酶，因为它们在协同反应中切割两个序列。IIT 型：这些限制性核酸内切酶由两个不同的亚基组成——一个具有限制性，另一个具有饰活性。IIB型：这种类型的限制性内切酶切割识别序列两侧的DNA，这可能是对称的或不对的。IIG型：属于这一亚型的酶在单个多肽链上具有限制和修饰活性。IIM型：这些限制性内切酶只识别甲基化DNA2.3 III型和IV型III 型酶的活性需要ATP。这些酶的识别序列和切割位点相距20-30个碱基。识别位点是反向的并且未甲基化。示例：EcoP15。IV型酶识别修饰的，典型的甲基化的DNA。它们也被称为甲基化依赖性限制性内切酶(MRDE)。它们的裂解是非特异性的。大肠杆菌的实施例MCRBC和MRR系统。MCRBC是从大肠杆菌K-12中分离出来的一种切割甲基化胞嘧啶DNA区域的核酸内切酶。它只需要甲基化的DNA，具有独特的环状结构。这些酶的特征较少，在重组DNA技术中也不经常使用。3 基于识别位点和切割特异性的分类限制性内切酶家族中的一些酶在识别位点的选择或产生相似的最终产物方面具有相似性，根据识别位点和切割特异性，它们被分为同裂酶、异裂酶和同尾酶。3.1 同裂酶这些是从不同生物中分离的一对酶，但具有相同的序列识别和裂解位点，可能需要改变酶活性的条件。按照惯例，原型是发现的第一个酶和识别序列。随后发现的酶是同裂聚体。例：SphI和BbuI有一个共同的裂解位点CGTAC/G。SphI从嗜色链霉菌（Streptomyces phaeochromogenes）中分离得到，BbuI从芽孢杆菌（Bacillus spp）中分离得到。另一对限制性内切酶HpaII和MspI识别5'-CCGG-3'序列，MspI只有在第二个胞嘧啶甲基化时才能识别，而HpaII不能识别。3.2 异裂酶异裂酶是指具有相同识别序列但切割位点不同的限制性内切酶。实例：SmaI酶和XmaI酶均能识别序列CCCGGG，切割位点如下：SmaI CCC *GGGXmaI C * CCGGG两者都产生不同类型的末端（SmaI的钝末端和XmaI的5′突出末端）。3.3 同尾酶这些限制性内切酶具有不同的识别序列，但在切割DNA时产生相同的终产物。这些序列可以彼此连接，并产生不能被限制性内切酶切割的新的不对称序列。这样的对可用于改变或除去限制性位点。4 新型限制性内切核酸酶一些限制性内切酶也被报道来自非细菌和非古生物来源。以下是一些例子：SacC1分离自酵母（酿酒酵母），一种真核生物，识别回文序列5′CTCGAC3′。这种酶在一条DNA链上距离识别位点5个碱基处和互补链上距离识别位点7个碱基处产生交错切割。该酶显示与假单胞菌属的Psp124B1相似的特征。据报道，限制性内切酶HsaI来源于人，从人胚胎中分离。它是EcoRI的同裂酶，具有与EcoRI不同的洗脱图谱。5 人工限制酶外源DNA可以通过使用限制性酶及其特异性切割位点引入受体DNA中。该方法已被用作基因编辑工具，使用超过250种天然存在的市售限制性内切酶。迄今为止，已经从几种细菌和古细菌中分离和鉴定了超过3600种限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶的使用可能是一种限制，主要是由于短的识别位点（4-8 bp），其可在长的DNA链中出现多次。最近，人工限制性内切酶（artificial restriction enzymes，AREs）解决了这一问题，该酶具有较长序列的识别位点，从而提高了特异性，导致非常少的切割位点和较长的粘性末端。这些酶是通过融合DNA结合域和核酸酶域而工程化的。这些战神可以靶向DNA的长链（高达36 bp）并结合DNA的期望区域。限制性内切酶导致了令人兴奋的基因编辑工具的发展。常见的例子是锌指核酸酶、CRISPR/Cas9细菌免疫系统和TALENs（转录激活子样效应核酸酶）。2010年，Murtola、Wenska和Strömberg报道了基于PNA的系统（Pnazymes）作为位点和序列特异性RNA酶。这些酶携带一个Cu(II)-2-9-二甲基邻菲罗啉基团，不切割RNA中的碱基配对区（RNA凸起），可能是未来RNA特异性限制性内切酶的基础[8]。2017年，伊利诺伊大学的Enghiad和Zhao展示了一种利用从一种古激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）中分离的Argonaute蛋白（PfAgo）创建ARES的新方法。由DNA引导的PFAGO能够识别长序列的酶切位点，从而增加待切割区域的特异性。PFAGO也会产生较长的粘性末端[9]。6 限制性内切酶在重组DNA技术中的应用限制性内切酶在特定识别位点切割DNA的特性使得这些酶在分子生物学技术中的应用成为可能。其中一些主要应用如下：6.1 克隆克隆是限制性内切酶在重组DNA技术中常见应用之一，用于产生重组DNA分子。该技术包括用相同的限制性内切酶切割供体DNA和载体DNA，产生相容的末端，这些末端可以通过一种叫做DNA连接酶的酶连接载体和供体DNA。然后产生的重组DNA可以保存在宿主中用于复制或用于转化。使用克隆方法可以创建大量的载体。但是，如果受体DNA不具有与供体相同的活性位点，则不能使用这种方法。6.2 限制性内切酶图谱限制性内切酶图谱是一种利用限制性内切酶处理目的DNA产生片段图谱的技术。通过在琼脂糖凝胶上电泳处理过的DNA，使不同大小的片段在凝胶上形成条带，从而产生图谱。这给出了目的DNA上限制性位点的相对位置的信息。因此，限制性内切核酸酶可用于获得DNA片段的结构信息或验证DNA片段的身份。DNA片段的限制性图谱对于所用的限制性内切酶组是唯一的。如果DNA在其序列中具有很少的限制性位点，则限制性作图的使用受到限制。6.3 限制性片段长度多态性该应用还利用了由单个或一组限制性内切酶在各种DNA片段上创建的限制性内切酶图谱。所获得的图谱可使用探针法用于验证所用DNA片段的一致性或检测多态性。消化的片段根据大小在凝胶上分离，并转移到膜上。然后用放射性或荧光探针标记这些片段，靶向限制性内切酶位点附近或限制性内切酶位点包围的的特定区域。研究中的每一个DNA（通常属于一个个体）都有一个独特的模式，称为“生物条形码”。当这种独特的模式在个体之间发生变化时，就会出现多态性。这项技术已被用于分析个体的DNA，然后可应用于基因定位、遗传性疾病的基因定位、疾病风险的确定，以及在法医科学中用于亲子鉴定。它也被用作检测再生植株体细胞无性系变异的测试工具。这不是一个高通量的系统，如果要筛选几个个体的多态性，它的用途将是有限的。7 总结限制性内切酶的发现及其作用机制表明：不同来源的DNA可以被同一限制性内切酶切割，并被连接酶连接在一起。这是可能的，因为不同DNA分子切端的互补性，这种互补性是分子生物学家构建重组DNA分子的一个非常有价值的工具。重组DNA技术、DNA诊断学、DNA鉴证学等新技术不断发展，并得到了广泛的应用。来源：摘译自A Complete Guide to Gene Cloning From Basic to Advanced, Chapter 4往期推荐阅读：悦读系列：重组DNA技术发展历史悦读系列：载体-基因递送载体指南悦读系列：基因分离方法—初学者指南识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。