纯化宝典：Source 15Q在寡核苷酸纯化中的应用

2022-11-29

寡核苷酸临床研究基因疗法

小核酸药物是目前发展最为迅速的基因疗法之一，作用机理是直接靶向致病靶基因或RNA片段，通常采用亚磷酰胺固相合成得到，具有高特异性。受限于合成效率以及原料质量，合成得到的初产物含有多种不同的杂质，最难控制的就是由于单个或多个寡核苷酸差异导致的失败序列（N-x/N+y）。由于产品和杂质之间在分子大小、电荷和疏水性方面的差异通常很小，合成后必须应用高分辨率纯化技术，才能达到目标分子与杂质分离的目的。阴离子交换层析（AIEX）是一种可以在水性条件下对寡核苷酸进行分离的实验方法，无需使用高成本含有机溶剂洗脱液，也无需对车间和设备进行防爆设计，特别适合用于纯化合成的寡核苷酸。其中应用最广泛的是Source 15Q，基架材质为聚苯乙烯，粒径15 μm，操作空间大，载量高，变性条件（pH 12）下依然可对寡核苷酸样品进行纯化操作，避免了单链自互补或者富含GC寡核苷酸聚集。本文以DNA样品为例，简述了Source 15Q在寡核苷酸（DNA）纯化中的工艺开发思路。Step 1：填料的结合载量测定为了确定适合工业生产和放大的结合载量，采用柱体积1 ml的RESOURCE Q纯化柱，测定了Source 15Q填料的动态结合载量。将粗寡核苷酸样品（Crude DNA oligonucleotide 20-mer）用平衡缓冲液稀释至浓度1.5 mg/ml，线性流速360 cm/h条件下，测得填料对该样品的动态结合载量为30 mg/ml（图1）。取该结合载量的60%作为后续实验中样品加载条件（即18 mg/ml），进行实验室小试和中试规模纯化操作。Sample ：20-mer oligonucleotide (1.5 mg/ml in 10 mM NaOH, pH 12)Flow rate ：360 cm/hColumn ：RESOURCE Q 1 ml (6.4 x 30 mm)Buffer A ：10 mM NaOH，pH 12Buffer B ：10 mM NaOH + 2 M NaCl, pH 12Detection ：UV-300 nm图1：Source 15Q对Crude DNA oligonucleotide 20-mer动态结合载量测定Step 2：在常规工艺柱高条件下进行实验并进行线性放大基于填料基架特性和放大考量，取柱高10cm和线性流速360 cm/h，在Source Q PE 4.6/100纯化柱上进行纯化工艺探索（图2A）。毛细管电泳分析回收样品纯度为97%。根据线性放大的原理，通过增加层析柱直径，同时保持柱床高度、线性流速以及结合载量等参数不变，对层析规模分别进行 5 倍（图2B）、58 倍（图2C）和230倍（图2D）放大。对收集样品进行纯度检测，结果表明，在所有放大规模上，Source 15Q一步纯化后，样品纯度均大于 97%（表 1 ）。图 2. Source 15Q对DNA寡核苷酸样品纯化图谱（流速360 cm/h。洗脱液A：10 mM NaOH，pH 12；洗脱液B：10 mM NaOH + 2 M NaCl, pH 12。梯度范围15-35%B in 40CV，检测UV-300 nm）注：A) 小规模纯化：SOURCE Q PE 4.6/100 （1.66 ml），总样品负载30mg。B) 5倍放大：SOURCE 15Q Tricorn 10/100 （7.85 ml），总样品负载141mg。C) 58倍放大：FineLINE Pilot 35（35/100mm，96 ml），总样品负载1825mg。D) 230倍放大：FineLINE Pilot 75（75/100mm，385 ml），总样品负载7000mg。表1. 不同纯化规模收率和纯度结果Step 3：通过Sephadex G25脱盐换液将产品置换到所需的bufferSource 15Q一步纯化得到的寡核苷酸中含有较高浓度的盐。可用Sephadex G-25或者TFF方法对样品进行脱盐处理，将样品置换至注射用水等样品活性友好的缓冲液中。图示（图3）脱盐的回收率为98%。Sample ：15 ml purified 20-mer oligonucleotideFlow rate ：60 cm/hColumn ：HiPrep 26/10 DesaltingBuffer A ：MilliQ WaterBuffer B ：10 mM NaOH + 2 M NaCl, pH 12Gradient ：15-35%B in 40CVDetection ：UV - 260 nm and conductivity图3. 纯化后寡核苷酸样品脱盐图谱关于Source 15Q 在寡核苷酸纯化中的一点思考和蛋白类样品纯化相似，寡合苷酸的纯化工艺需要考虑多种因素的影响，例如纯化缓冲液pH和盐离子浓度、载量、流速、操作压力、柱床高度、以及操作温度等。需要根据样品是否脱去最后一个DMT基团以及寡合苷酸长度来调整洗脱盐离子浓度和洗脱体积。1纯化缓冲液pH和盐离子浓度是目标分子洗脱的重要因素之一。高pH洗脱剂的一个重要用途是控制单链自互补或者高GC条件下形成氢键聚集。大多数相互作用在pH 12时可以被打开。但是RNA在碱性条件下不稳定，必须在中性环境下进行纯化（图4）。另一方面，如果洗脱需要的氯化钠浓度过高，也可以更换成离子强度更大的溴化钠或者其他二价盐离子进行洗脱。Sample ：Crude RNA oligonucleotide 30mer 100ugFlow rate ：360 ml/minColumn ：Source Q PE 4.6/100Buffer A ：10 mM Tris + 1 mM EDTA ，pH 7.5Buffer B ：10 mM Tris + 1 mM EDTA + 1 M NaCl ，pH 7.5Gradient ：15-60%B in 15CVDetection ：UV-260 nm图4：Source 15Q对RNA寡核苷酸样品纯化图谱2样品载量和保留时间在纯化过程中同样需要被关注。相比于传统的蛋白分子，寡核苷酸分子量低，电荷和疏水基团相对较少，可以适当调整保留时间和载量，达到更好的分离效果。3纯化温度是最具挑战性的参数之一。不同样品热稳定性存在差异。一般室温条件下即可达到很好的纯化效果，但有时也需要对纯化温度进行优化。例如对于RNA样品而言，有文献[3]报道最佳纯化温度为40-50°C。低于30°C或高于50℃均会造成纯化效果变差。此外，保证整个纯化环境温度的一致也很重要。图5. 纯化温度对RNA纯化的影响（载量25 mg/ml，线性流速200 cm/h，洗脱液A：Na3PO4 / ACN，洗脱液B : Na3PO4 / ACN +1M NaBr）除本文提到的Source 15Q外，还可以根据寡核苷酸分子大小、电荷和疏水性方面的差异，采用离子交换层析、疏水层析、及反相层析并进行合理组合。这些纯化方法在核酸合成5G时代（下篇）：寡核苷酸的纯化策略一文中均有提到。寡核苷酸的一步纯化方法开发需要在不同批次样品以及不同规模下进行多次实验验证。稳定的上游合成过程是下游纯化工艺稳定的基础和前提。Cytiva可以提供从小试到商业化规模、从上游合成到下游纯化及超滤设备、从固相合成载体到纯化填料以及中空纤维的整体解决方案，具体可咨询当地销售或技术团队咨询详情。订购信息：参考文献：1.Jamil Shanagar. Purification of a synthetic oligonucleotide by anion exchange chromatography: Method optimisation and scale-up. J. Biochem. Biophys. Methods 64 (2005) 216 – 2252.Vegvari, A. and Hjerten, S. "Stable homogeneous gel for molecular-sieving of DNA fragments in capillary electrophoresis" J. Chromatogr. A, 960, 221–227 (2002).3.Eduardo Paredes and Tatsuya Konishi. Large-Scale Oligonucleotide Manufacturing.4.Strategies for large scale purification of synthetic oligonucleotides.5.Mohammad, J., Bhan, A, Bhadti, V and Almer, H. Purification of synthetic RNA oligonucleotides by anion exchange- and reversed phase- chromatography: method development and optimisation