Nature：诺奖得主新作！揭秘CRISPR系统进行基因组扩增的全新机制

2023-06-17

基因疗法临床研究

本文转载自“丁香学术”2020年，科学家Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna因开发了用于基因组编辑的CRISPR技术而摘得诺贝尔化学奖的桂冠。目前，基于CRISPR-Cas9基因编辑的多项临床实验也已启动并获得突破性结果，为许多遗传疾病的治疗开辟了新的途径。CRISPR-Cas系统就像宿主的免疫系统，它可以捕获DNA片段并将其整合到自己的基因组中，以增强对病原的防御能力。它就像一个特工，可以识别哪些DNA是「朋友」，哪些DNA是「敌人」，从而维持基因组的完整性，避免错误地攻击自己。CRISPR-Cas系统中的Cas1:Cas2整合酶在这个过程中扮演着重要角色，但它们自己还不足以完成整个任务。有趣的是，微生物中的Cas4内切酶成了这个任务的帮手。然而，并不是所有的 CRISPR系统都有Cas4内切酶。有些CRISPR系统使用一种内外兼修的外切酶来选择和加工DNA，并与Cas1:Cas2合作，一起完成DNA的捕获、修整和整合的工作。在这个过程中，外切酶整合酶会对DNA进行不对称的加工，在整合之前和之中生成特定大小的DNA碎片，并带有PAM序列，这个序列就像一个标记，告诉系统这是自己的DNA，以防止CRISPR系统错误地攻击宿主自己的基因组。这些发现支持了一个理论模型，即缺乏Cas4内切酶的CRISPR系统会使用与之合作或被吸纳的外切酶来获取新的CRISPR免疫序列，就像它们在寻找宿主的DNA朋友一样。这为作者理解CRISPR系统的运作方式提供了新的视角。2023年6月15日，诺奖得主Jennifer A. Doudna在顶级学术期刊Nature杂志上以Genome expansion by a CRISPR trimmer-integrase为题发表了相关研究。这项研究详细描述了CRISPR适应性免疫机制的高效工作方式。研究人员模拟重组了Cas1:Cas2-DEDDh复合物，发现外切酶在前间隔处理和整合的第一步中保留了 PAM，并由DEDDh活性位点去除。这与已知的Cas4不同，表明宿主外切酶在 PAM处理中具有不同功能。整合酶调节外切酶活性，协调PAM处理和整合 DNA。图片来源：Nature主要结果01Cas1:Cas2-DEDDh介导CRISPR的整合作用作者探究了Cas2-DEDDh在CRISPR前间隔处理中的功能。作者制备和纯化了 Cas1蛋白和Cas2-DEDDh蛋白，并在体外评估了它们对DNA底物的处理能力。根据Megasphaera CRISPR阵列中spacer的长度和I-E型大肠杆菌Cas1:Cas2整合酶对底物的优先选择，推测首选的整合底物可能是一个含有23个碱基的双链 DNA，其中5个碱基在3'末端形成了一个单链突出部分。为了评估这些酶的处理活性，他们使用了带有不同长度延伸单链3'末端突出部分的5'荧光标记前间隔底物进行Cas1和Cas2-DEDDh的修剪活性测定。结果只有 Cas1:Cas2-DEDDh复合物能够产生与宿主CRISPR阵列中spacer长度相等的底物。整合酶需要一个含有23个碱基的双链DNA才能实现功能性处理。DEDDh活性位点在处理活性中起关键作用，突变体复合物无法有效处理前间隔。这些结果表明完整的Cas1:Cas2-DEDDh复合物在前间隔处理中起到必要的作用，DEDDh活性位点具有核酸降解活性。图1：Cas1:Cas2-DEDDh将前间隔处理为正确的整合大小并保护TT PAM。（来源：Nature）实验结果显示，不同长度的前间隔底物处理效率相似。为了更好地了解前间隔处理的动力学，研究人员将荧光标记的前间隔与包含CRISPR的质粒进行了合并。结果表明，与具有延长突出部分的前间隔相比，经典底物的整合效率更高。连接产物在2分钟后就产生，而具有延长突出部分的前间隔需要10分钟才能检测到连接产物。这结果显示，在连接到CRISPR之前，通过DEDDh的修剪，Cas1:Cas2-DEDDh提供了一个分子标尺，使得前间隔适合整合。02Cas1:Cas2-DEDDh修剪PAM 为了研究PAM对前间隔处理的影响，研究人员改变了PA区域。结果显示，Cas1:Cas2-DEDDh在5'-TT位置识别PAM。在没有TT PAM的情况下，DEDDh 将前间隔链修剪到适合整合的大小。然而，在正确的位置存在TT PAM时，DEDDh导致有PAM的链的部分修剪，生成一个33nt的产物。猜测这部分修剪是由于Cas1中PAM结合口袋的隔离所致，该口袋可以保护PAM和相邻的3个核苷酸免受核酸酶的作用。为了揭示前间隔处理和PAM保护的结构基础，研究人员解析了Cas1:Cas2-DEDDh与含有和不含有TT PAM的前间隔底物的结构。Cas1:Cas2保留了经典的异六聚体结构，包含两个Cas1二聚体和一个中央的Cas2二聚体桥接。一个23bp 的双链底物位于复合物的顶部，而5个核苷酸单链3'末端突出部分延伸到Cas1两个界面的裂隙中。图2：前间隔处理过程中的Cas1:Cas2-DEDDh的分子细节。（来源：Nature）Cas1和Cas2-DEDDh是一对内部测量器，用于确保每个CRISPR阵列中间隔的长度相等。通过双重的Cas1 His29残基，利用与23个碱基对的DNA双链末端π堆叠的方式测量长度，并固定前间隔链。DEDDh首先负责保护PAM。冷冻电镜分析显示，DEDDh活性位点与含有PAM的前间隔DNA分子发生相互作用。与Cas1a'的特定序列结合后，解释了PAM的识别机制。第一个PAM胸腺嘧啶位于Cas1a'的深层口袋中，与Tyr126和Gly148形成氢键。第二个PAM胸腺嘧啶与Tyr171发生π堆叠作用，使T3能够与Tyr171的骨架酰胺氮形成氢键。当没有PAM存在时，底物会被完全修剪，突出了序列特异性相互作用对对称修剪和PAM保护的重要性。此外，Cas1b'的C端区域起到了封存被修剪核苷酸的作用。DEDDh切断前间隔的突出部分，PAM结合口袋和C端夹阻止了进一步修剪，从而防止了对PAM和额外核苷酸的切割。尽管存在高浓度的非特异性外切酶，但修剪过程仍然是精确的。在CRISPR适应过程中，PAM必须在下游被切割，这是保护机制的自然结果。图3：Cas1:Cas2-DEDDh PAM的生化和结构分析。（来源：Nature）在DNA半整合之后，DEDDh会剪切PAM。为了避免自身免疫，PAM必须在插入 CRISPR阵列之前被移除。在DEDDh催化失活条件下，整合产物链的缺失表明 DEDDh活性位点扮演着处理PAM的角色，Cas1与CRISPR阵列相互作用时会释放PAM供DEDDh修剪。研究揭示了Cas1:Cas2-DEDDh复合物对PAM的处理机制，同时定义了间隔的大小并阻止了PAM插入CRISPR阵列。生化数据表明，DEDDh结构域能够修剪PAM，而PAM修剪活性是整合的必要条件。重复DNA与Cas1a'之间存在序列特异性相互作用。这些相互作用是由环3和螺旋4的连续二级结构决定的。图4：Cas1:Cas2-DEDDh介导的体外全位点整合的重建。（来源：Nature）Cas1:Cas2-DEDDh复合物在整合过程中扮演了重要角色。整合事件发生在DNA 重复序列的边界处，不仅仅是在特定位置附近。最初认为Cas1:Cas2-DEDDh复合物是用来识别和保护PAM序列的，但实际上它在整合之前会去除PAM序列。混合实验发现没有PAM序列的样本整合的数量显著增加，表明整合酶在选择底物之前可能会检查是否存在PAM序列。整合酶对待处理的DNA结构表现出了类似的严谨性。总结与展望这项研究详细描述了CRISPR适应性免疫机制的高效工作方式，包括Cas1:Cas2-DEDDh复合物对DNA的处理和整合过程。研究发现，与已知的Cas4内切酶相比，这种修剪酶整合酶使用了一种新的PAM处理机制。此外，研究还揭示了Cas1 通过对DNA进行保护，迅速暴露并去除PAM序列，以确保其正常工作。此外，DEDDh酶在DNA的特定部位降解PAM序列，并在相邻的重复/间隔处发起反应。这项研究为作者了解DNA处理和选择过程提供了重要见解，并为进一步改进 CRISPR技术中的Cas1:Cas2复合体提供了指导。未来的实验应该利用这种有效的修剪整合酶来解决CRISPR适应性免疫机制中的未解之谜，并进一步发展全面的体外CRISPR适应性技术。责编|文竞择校对|文竞择End参考资料：[1]Joy Y. Wang, Owen T. Tuck, Petr Skopintsev, et al. Doudna.Genome expansion by a CRISPR trimmer integrase. Nature. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-023-06178-2 往期精选围观历史性突破！不需卵子和精子就可以合成人类胚胎热文富豪用儿子血浆“回春”科学吗？Science：血液牛磺酸缺乏驱动衰老热文世界首例！35岁的她，通过机器人操刀移植的子宫，成功诞下宝宝热文‍为了避免心脏骤停，53岁的他成为“第一个”植入开创性除颤器的心脏病患者热文首次披露！175家生物制药公司的薪资数据：薪资中位数达20万美元点击“阅读原文”，了解更多~