Nat Methods | 自主生物发光成像技术在真核生物中的创新进展

2024-01-25

引言在现代生物医学研究领域，生物发光成像技术凭借其非侵入性、无需外加光源以及高灵敏度的独特优势，已经成为研究生物体内各种生理和病理过程的重要工具。特别是随着1月22日一项研究成果（An improved pathway for autonomous bioluminescence imaging in eukaryotes）在Nat Methods （IF 48）杂志上的发表，科学家们通过对霓虹灯菌(Neonothopanus nambi)中的生物发光途径进行改良，成功实现了在植物、真菌和哺乳动物宿主中自主发光亮度的显著提升，这一成就无疑为生物发光成像技术的进一步发展和广泛应用提供了强有力的支持。自然界的生物发光现象一直是科学家们研究的热门话题。霓虹灯菌的发现为在非自发光的真核生物中引入自主发光的可能性提供了新的思路。然而，将这一现象应用于异源宿主时，由于原生真菌酶的性能限制，其发光亮度往往难以满足实验要求，这成为推广其应用的一大障碍。在这项研究中，科学家们成功优化了真核生物中的自主生物发光途径，显著提高了在植物、真菌和哺乳动物宿主中的生物发光亮度。通过对Neonothopanus nambi真菌中的生物发光途径组分进行定向进化和改造，研究团队开发出了两种优化的生物发光途径版本：FBP2和FBP3，它们在多种宿主中实现了比原始途径（FBP1）高出一个到两个数量级的发光亮度。研究中涉及对两个关键酶nnLuz（荧光素酶）和nnH3H（hispidin-3-羟化酶）的改造。对nnLuz的定向进化产生了含有三个氨基酸替换（T99P, T192S和A199P）的nnLuz_v3变体，这些替换增加了其在细菌和哺乳动物细胞中的稳定性和亮度。进一步的随机突变产生了nnLuz_v4，它包含了额外的四个氨基酸替换（I3S, N4T, F11L和I63T），在酵母中显示出改善的热稳定性和催化活性。nnH3H的定向进化确定了五个增强亮度的氨基酸替换（D37E, V181I, A183P, S323M和M385K）。通过组合这些突变，得到了进一步增强亮度的nnH3H_v2。此外，研究还发现，来自Mycena citricolor的hispidin合成酶mcitHispS在多种异源宿主中的表现优于nnHispS，尤其是在植物中。通过将改造后的酶组合在一起，形成了FBP2（包含nnHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH和NpgA）和FBP3（包含mcitHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH和NpgA）两种优化途径。在实验中，FBP2和FBP3在植物、酵母和哺乳动物细胞培养系统中表现出了明显的亮度优势。特别是在植物中，FBP2和FBP3不仅提高了发光亮度，而且在六个代表四个双子叶植物科的物种中实现了稳定的转基因表达，这些物种包括模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana benthamiana），以及快速生长的树种加拿大杨（Populus canadensis）、观赏植物矮牵牛（Petunia hybrida）和菊花（Chrysanthemum morifolium）。研究结果表明，FBP2和FBP3具有在植物中实现视频速率生物发光成像的潜力，即使在微弱的外部光照条件下也能使用消费级相机可靠地监测植物的生物发光。最明亮的组织——矮牵牛的花蕾甚至可以使用现代智能手机相机进行记录。转基因植株稳定表达生物发光途径不同版本的发光性：3周龄尼古丁树叶的平均亮度（Credit: Nat Methods）Methods速览定向进化与共识突变分析：对N. nambi的荧光素酶nnLuz和hispidin-3-羟化酶nnH3H进行定向进化和共识突变分析，通过筛选获得具有增强稳定性和亮度的nnLuz_v3和nnLuz_v4变体，以及提高亮度的nnH3H_v2变体。基因表达与瞬时转染：将改良后的生物发光基因构建到表达载体中，并通过瞬时转染的方式将其引入植物（如烟草Nicotiana benthamiana和拟南芥Arabidopsis thaliana）、酵母（如Pichia pastoris）和哺乳动物细胞（如人类HEK293细胞）中，以评估改良途径的生物发光性能。酶活性与热稳定性测试：在细菌、酵母和哺乳动物细胞中测试改良酶的活性和热稳定性，通过添加底物并使用荧光计或相机捕捉发光信号，从而评估酶的性能。农杆菌介导的植物转化：利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转化方法，将改良的生物发光基因稳定整合到植物基因组中，创建能够稳定发光的转基因植物系。发光成像与数据分析：使用IVIS Spectrum CT等成像系统或普通数码相机，在无外部光源的条件下捕获植物、细胞或酵母的自主生物发光图像。通过图像处理软件对捕获的图像进行分析，定量评估发光信号的强度和分布。这一创新性研究成果的实现，极大地拓宽了生物发光成像技术在植物学、神经科学、发育生物学等多个学科领域的应用范围，同时也为今后的研究提供了新的方向。其完全基因编码的特性，使实验操作变得更加简便，大大降低了研究成本，提高了实验效率。未来，随着对该技术的进一步优化和改进，预期将在更广泛的生物体系中实现更高效、更稳定的自主发光，为生物医学研究乃至临床诊断提供更加强大的技术支撑。参考文献https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41592-023-02152-y责编|探索君排版|探索君End往期精选围观Nat Med | 黄荷凤院士/张静澜/徐晨明团队发表综合性无创产前筛查临床研究成果热文Science最新发布：全世界最前沿的125个科学问题热文不孕症治疗新方向！又一导致女性不孕的关键因素被发现热文Let-7家族miRNA或为癌症潜在免疫治疗靶点热文一项最新发现或可用于阿尔茨海默病药物开发