Anti-rabies monoclonal antibody(MassBiologics)

摘要:一系列重组单克隆抗体（rMAbs）已被用于治疗多种疾病，包括各种癌症和免疫系统疾病。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞已成为生产这些rMAbs的首选，因为它们具有强大的稳定性、易于转染，以及与人类细胞相似的翻译后修饰能力。可以通过瞬时转染和/或稳定表达在CHO细胞中表达rMAbs。为了提高CHO细胞中rMAbs的产量，已经开发了多种方法，包括载体优化、培养基配方、培养参数和细胞工程。本文简要概述了这些方法，并同时讨论了生产过程中遇到的挑战，如聚集和岩藻糖基化问题。 1.引言 作为免疫球蛋白（Ig）超家族的成员，抗体（Abs）是由浆细胞分泌的糖蛋白。在结构上，Abs由两条重链（HCs）和两条轻链（LC）通过共价和非共价相互作用交织而成，形成通过柔性铰链区域连接的三个片段。这些片段包括两个抗原特异性结合（Fab）域，用于附着于抗原，以及一个可结晶片段（Fc）域，负责启动效应功能。在人类中，根据HC的不同恒定区域结构和性质，Abs被分为五个类别：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。其中，IgG是血清中最普遍的类别，具有较长的半衰期，占循环抗体的75%。 由于市场需求强劲，制药工业蓬勃发展，全球处方药销售额在2017年超过了1万亿美元。美国食品药品监督管理局批准的生物制药中，相当一部分由重组单克隆抗体（rMAbs）或其偶联物组成。2017年全球单克隆抗体（mAb）市场超过了1000亿美元。自2016年以来，大约70%的所有重组抗体由仓鼠卵巢（CHO）细胞系生产。这些rMAbs被用于治疗各种疾病，包括癌症、自身免疫病和炎症性疾病。预计到2025年市场价值将超过3000亿美元，rMAbs站在生物制药的前沿，在治疗批准方面处于领先地位。此外，单克隆抗体的截短版本，如Fab片段，也用于治疗和研究领域。rMAbs和（Fab）s的产生采用了多种表达系统。大肠杆菌（E. coli）因其流程简洁，能在较短时间内产出克/升级别的量而受到青睐，用于生产Fab分子。除了细菌如大肠杆菌外，还采用了各种表达系统来生产重组抗体。这些表达系统的比较详见表1。为了治疗目的，rMAbs需要精确的糖基化和其他翻译后修饰才能发挥其预期的生物功能。因此，获准用于人类治疗的rMAbs仅限于在哺乳动物细胞中生产，如CHO、小鼠骨髓瘤细胞系（NS0）和Sp2/0细胞，这归因于它们进行复杂翻译后修饰的能力。CHO细胞特别受到青睐，用于生产rMAbs，因为CHO细胞产生的rMAbs在结构和功能上与天然mAbs相似，对人类病毒有抵抗力，外源基因稳定整合，内源性蛋白分泌少，便于分离，且适合大规模悬浮培养。2020年之前在CHO细胞中生产的治疗性rMAbs已在一篇综述文章中记录。因此，表2列出了美国或欧盟最近批准的治疗性重组抗体，它们在CHO细胞中生产。值得注意的是，2021年和2022年美国或欧盟批准的治疗性重组抗体中，只有一种在NS0细胞中生产，其余均在CHO细胞中制造。因此，经过多年的专注研究和开发，CHO细胞已成为抗体生产最普遍的宿主细胞系，主要是因为它们能够执行对治疗效果至关重要的单克隆抗体所需的翻译后修饰。 鉴于这些优势，治疗性rMAbs主要在CHO细胞中制造，随后进行色谱纯化。1986年第一个获准上市的重组治疗蛋白（组织型纤溶酶原激活剂）的表达滴度为<50 mg/L。30年后，基于CHO的rMAb生产过程已达到高度完善，通常在批处理过程中实现约1 g/L的峰值产品滴度，在连续批操作中实现1-10 g/L。为了增加CHO细胞中rMAb的产量，采用了多种策略，包括定制载体设计、优化生长培养基配方、控制培养条件和潜在的细胞工程增强。 2.构建策略 表达载体在CHO细胞内异源rMAbs的表达中起着关键作用。这个载体基本上控制着rMAb在瞬时和稳定表达中的表达程度和质量。图1所示的表达质粒所涉及的步骤包括从启动子转录、RNA剪接生成mRNA、mRNA翻译、翻译调控等。为了提高这些外源基因的表达效率，在载体构建中采用了各种方法。 1.启动子：目前CHO细胞表达载体中使用的突出启动子来源于猴空泡病毒40（SV40）、人类巨细胞病毒（CMV）即刻早期（IE）启动子和延伸因子-1α（EF-1α）。其中，EF-1α启动子的效力最高。对启动子的修改已经证明能够增强CHO细胞中的抗体生产。 2.5'-非翻译区（5'-UTR）：在Hsp70 mRNA的UTR中发现了一个增强翻译的元素，增加了依赖帽子结构的翻译效率。5'-UTR内的RNA结构被公认为影响翻译效率的角色。这一见解提供了一种系统的方法来微调哺乳动物细胞中的蛋白质表达水平，最终有助于提高重组蛋白的表达。 3.内含子：内含子在调节外源基因表达中具有增强能力。之前已经进行了比较分析，研究了五种不同内含子对CHO细胞中外源基因表达的影响。在这些内含子中，SV40内含子在瞬时和稳定转染条件下均显示出最高的外源基因表达水平。值得注意的是，该内含子还在CHO细胞内显著提高了重组蛋白的生产。 4.信号肽：新合成的蛋白质通过其信号肽从细胞质转移到内质网（ER），这是蛋白质分泌的关键阶段，特别是在抗体的情况下。通过使用小鼠IgGκ信号肽，已成功在CHO细胞表达系统中高效生产CYTL1蛋白。此外，已经展示了对HC和LC的信号肽进行优化，展示了它们在实现CHO细胞中治疗性抗体高效表达中的作用。 5.密码子优化：将抗体可变区中的密码子替换为天然人类抗体基因中的首选密码子，可显著提高哺乳动物细胞中抗体表达水平，增加幅度从两到三倍。在密码子和/或5'-UTR内精炼序列应进一步增强HC和/或LC蛋白的翻译，就像优化mRNA UTR以改善治疗性mRNA和mRNA疫苗的表达。实际上，已经证明HC基因的基因优化可以增强其mRNA稳定性，进而增加抗体生产。 图1：在哺乳动物细胞（例如中国仓鼠卵巢细胞）中表达重组抗体。已经采用了几种方法来增强重组抗体的表达，例如选择启动子、结合含有5'-UTR的内含子、优化表达基因的密码子、控制LC/HC的比例等。HC：重链，LC：轻链，UTR：未翻译区域。 除了上述构建表达质粒的方法外，出现了多种策略以促进CHO细胞中rMAbs的表达。这些策略包括单顺反子载体、双启动子表达载体和由内部核糖体进入位点（IRES）或Furin-2A介导的双顺反子载体[图2]。单顺反子载体从质粒表达单一蛋白。在CHO细胞内生成rMAbs时，使用两个单独的单顺反子载体分别表达HC和LC[图2(I)]。在双启动子表达载体中，两个不同的启动子分别调控HC和LC mRNA的转录[图2(II)]。然而，双启动子载体的能力本质上是有限的，这在容纳超过两个转录单元时带来挑战。这种限制限制了这种方法的应用。另一方面，双顺反子载体使LC和HC能够在单个mRNA中共同表达，由单个启动子驱动。这些载体为LC和HC蛋白提供平衡的生产水平，从而在最小化聚集和一致的糖基化的情况下提高rMAb表达。可以使用IRES或Furin-2A肽制定两种变体的双顺反子载体[图2(III)]。 图2：重组单克隆抗体表达载体的示意图 (I) 单顺反子载体， (II) 双启动子表达载体， (III) 双顺反子载体： (a) IRES介导的载体，(b) Furin-2A介导的载体。HC：重链，LC：轻链，PolyA：聚腺苷酸信号，IRES：内部核糖体进入，F2A：Furin-2A。通常使用的启动子来源于猴空泡病毒40、人类巨细胞病毒即刻早期启动子和延伸因子-1α。普鲁霉素和硫酸blasticidin被广泛用作筛选抗生素，以建立稳定的细胞克隆。 IRES是发现于某些病毒基因组中的非编码序列片段，通常位于RNA病毒（例如脑心肌炎病毒和丙型肝炎病毒）的5'-UTR。IRES促进帽子独立翻译启动，能够从单一mRNA转录本表达多种蛋白。另一方面，Furin-2A介导的载体由于其高效的“自切割”机制而成为一个可行的选择，确保从单一开放阅读框中比较均衡地表达轻链和HC。2A肽是由大约20个氨基酸组成的“自切割”肽，存在于小核糖体病毒中。已知有四种2A肽，分别来自口蹄疫病毒（F2A）、马鼻炎病毒（E2A）、猪睾丸病毒-1（P2A）和Thosea asigna病毒（T2A）。在LC和HC多肽之间整合2A肽，通过2A多肽C-末端的共翻译切割，触发不同的LC和HC段的生产，从而实现HC和LC蛋白的平衡共表达。 除了像普鲁霉素（PURO）这样的抗生素筛选系统外，另一种方法涉及创建二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞，这些细胞可以使用含有甲氨蝶呤的培养基进行培养和筛选。这种技术允许在有限的时间内生成稳定的细胞系。 此外，整合普遍染色质开放元件（UCOES）序列已被证明能够增强CHO细胞中的抗体生产。UCOEs的特征在于它们能够可靠地提供稳定的转基因表达，这种表达与整合位点无关，并且与拷贝数直接成比例。在结构上，UCOEs由无甲基化CpG岛组成，这些岛包含单向或双向转录的管家基因启动子。 3.在CHO细胞中表达rMAbs过程中遇到的各种困难 在CHO细胞中表达rMAbs时出现了许多挑战。某些障碍可能会影响这些rMAbs的有效性，需要解决。 3.1. 聚集 鉴于在动物和人类中引发免疫原性反应的潜力，控制治疗产品中抗体聚集至关重要。使用CHO细胞生产rMAbs时，由于诸如氨基酸序列、细胞系特性、克隆多样性和细胞培养条件等因素，产生的抗体聚集可能会有所不同。抗体聚集的性质可以根据溶解度、共价或非共价相互作用、可逆性和单体变性而不同。值得注意的是，较低的培养温度可以在稳定表达rMAbs的CHO细胞中增加抗体聚集形成，这是由于LC和HC的转录增加，加上内质网机械的限制。可以使用尺寸排除色谱法检测这些聚集体。 为了减少聚集趋势，已设计了许多策略。例如，将海藻糖（一种由两个α-葡萄糖单元组成的二糖）纳入培养基中，已显示出避免聚集的前景。此外，与抗体共表达分子伴侣，例如二硫异构酶蛋白二硫异构酶（PDIa4），可以通过避免抗体的错误折叠有效减少聚集体的形成。 3.2. 翻译后修饰 3.2.1. 糖基化 rMAbs最常见的翻译后修饰涉及CH2域（HC的恒定区域）中保守的天冬酰胺残基的糖基化。在rMAb生产过程中的过程变化经常导致寡糖谱的变化。先前已经广泛研究并回顾了在rMAbs中常见的寡糖，详细说明了它们对结构、稳定性和生物功能的影响。值得注意的是，rMAbs上的特定糖型可以对其生物活性和治疗特性产生重大影响。例如，高甘露糖可以加速抗体清除率，而无岩藻糖基化、双分支GlcNAc残基和高甘露糖可以增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。相反，去糖基化的IgG抗体缺乏引发体内炎症反应的能力。因此，为了治疗目的，在CHO细胞中生产去糖基化的rMAbs是首选的。 3.2.2. 羟基化 在rMAbs中观察到赖氨酸残基的羟基化，位于共识序列（XKG）中，这被认为是其他蛋白质（如胶原蛋白）中的修饰位点。这种羟基化被推测是由CHO细胞中与赖氨酸羟化酶复合体相当的活性产生的。这种与胶原蛋白的类比和共识序列的存在导致了CHO细胞在rMAbs中对赖氨酸进行羟基化的类似酶促过程的假设。 3.3. 遗传不稳定性 在通过工程哺乳动物细胞进行rMAbs的工业生物加工中遇到的一个主要挑战是细胞系不稳定性的发生。这种现象涉及生产细胞系的特定生产力下降。生产的不稳定性可以归因于两个关键机制：（1）表观遗传不稳定性，特征是甲基化诱导的启动子（如CMV IE）的转录沉默，该启动子负责驱动rMAb基因的转录；（2）遗传不稳定性，表现为在增殖的CHO细胞群体中rMAb基因拷贝数的逐渐减少。 3.4. 片段化 rMAbs的片段化是一个普遍的挑战，影响蛋白稳定性，需要在生产过程开发过程中进行严格的质量控制监督。残留宿主细胞蛋白酶的存在是导致rMAbs片段化的一个重要因素。 3.5. 二硫键还原 在CHO细胞培养中生产的rMAbs在收获程序和/或蛋白A色谱阶段可能会发生链间二硫键的显著还原。这种现象可能导致检测到包含LC、HC以及两者的多种组合的抗体片段。 3.6. 蛋氨酸氧化 蛋氨酸（Met）残基的氧化是蛋白质降解的常见途径之一。在rMAbs的背景下，特定Met256和Met432残基的氧化被识别为导致其与蛋白A和蛋白G的相互作用发生变化。这种改变导致rMAb与这些蛋白质之间的结合亲和力降低。 3.7. 移码突变 移码突变可能导致预期氨基酸序列的完全改变，可能影响蛋白治疗剂的生物功能，并引入免疫原性风险。值得注意的一个例子是在细胞系筛选研究过程中，使用CHO细胞生产的治疗性IgG1 rMAb中发现并分析了一种新-1移码变体。 4.培养条件 在过去几十年中，细胞培养技术经历了显著的进步，已转变为一种相对可靠和有韧性的方法。这一进展中的一个关键成就是增强型化学定义培养基的创造和商业可用性。媒体发展的另一个显著突破是向无血清配方的转变。 培养基组成的优化导致了提出加入各种化学物质以增强细胞培养条件的建议。其中，特定代谢物如苏氨酸和花生四烯酸被提出作为细胞培养基的潜在添加物。值得注意的是，丁酸钠（NaBu）因其能够提高CHO细胞中rMAbs的特定生产力而受到关注。这种效应归因于NaBu对rMAbs的半乳糖基化的影响，从而改善了这些抗体的正确组装。 单克隆抗体是复杂的异质糖蛋白，经历多重翻译后修饰，导致各种变体，例如特定mAb的电荷变体。通过阳离子交换色谱法可以检测到电荷变体，其中酸性mAb峰先于主峰，碱性mAb峰后于主峰。传统上，离子排除色谱（IEC）已用于mAb纯化。先前的研究调查了细胞培养过程控制和离子补充对CHO细胞产生的mAb电荷变体的影响。研究发现，在3L生物反应器中的最优条件下，特别是Zn2+和温度变化，观察到显著的增强，进一步提高了抗体质量。主峰增加了12%，酸性峰减少了16%，滴度没有明显损失。这些结果为增强mAb生产中遇到的电荷变体提供了宝贵的见解。 此外，连续灌注已证明能够维持比间歇灌注培养更高水平的细胞密度、产品滴度和质量。通过结合高灌注率和在第6天延迟降低培养温度，产品滴度达到了16.19 g/L的峰值水平，单体的相对丰度为97.6%。为了验证优化的灌注培养在更大规模上的有效性，使用了200L生物反应器，到第16天产品滴度最高达到了16.79 g/L。这项研究为通过优化的灌注培养策略实现CHO细胞高效生产mAb提供了宝贵的见解。 5.宿主细胞工程 宿主细胞工程已成为通过操纵CHO细胞中特定基因表达来增强rMAbs生产的一种策略。许多研究的焦点是凋亡，这是一种重要的细胞死亡形式，这促使开发了通过各种策略产生抗凋亡细胞系。这些策略包括引入抗凋亡Bcl-2样蛋白、抑制促凋亡因子或抑制p53肿瘤抑制蛋白等方法。同样，在重组CHO细胞中过度表达人类端粒酶逆转录酶也被追求以促进增殖并增强对凋亡的抵抗力。此外，过度表达分子伴侣已被用来促进重组且通常复杂的蛋白质的有效成熟，或减轻未折叠蛋白反应，以对抗来自细胞压力的凋亡。 在CHO细胞内提高细胞分裂周期25同源物A的表达，有可能通过在细胞系开发的初始阶段操纵细胞周期来增强传统基因放大系统。因此，这种操纵导致转基因拷贝数迅速增加，转基因表达显著放大。 在异源蛋白表达中的另一个挑战涉及分泌途径，从新生多肽链的易位到ER开始。不正确的信号肽切割可能导致LC聚集。为了减轻这个问题，已进行了SRP14（信号识别粒子的一个组成部分）的过度表达，从而显著提高了难以生产的抗体的特定生产力。 此外，已经证明PDI的短暂过度表达可以提高rMAb分泌率。此外，已经确定了两种miRNA（miR‑557和miR‑1287）对表达rMAb的CHO细胞中的活细胞密度和特定生产力的积极影响。 为了通过增加突变来增强rMAbs的亲和力，探索了几种策略。激活诱导的胞嘧啶脱氨酶（AID）通过将脱氧胞嘧啶转化为脱氧尿嘧啶来启动体细胞超突变，从而诱导额外的突变。AID在B细胞中多样化抗体库中发挥关键作用。将表达AID的质粒引入CHO细胞已被用来提高所产生抗体的亲和力、特异性和稳定性。 6. 影响重组单克隆抗体产量的因素 除了CHO细胞外，还采用了多种系统来生成重组蛋白，包括瞬时和稳定表达方法。探索在其他细胞类型中使用的条件下在CHO细胞中应用的可能性可能是有价值的。 6.1. 2-氨基嘌呤对重组单克隆抗体在仓鼠卵巢细胞中生产的影响 2-氨基嘌呤（2-AP）对CHO细胞中rMAb生产的特定影响尚不清楚。然而，在人类细胞系中，2-AP已被证明可以增强外源基因的瞬时表达。在CHO细胞中可能观察到类似的效应，可能导致rMAbs的瞬时表达增加。需要进一步的研究来确定2-AP对CHO细胞中rMAb生产确切影响。 6.2. 蛋白激酶R和核糖核酸酶L对仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体瞬时表达的影响 蛋白激酶R (PKR) 和 2'-5'联腺苷酸依赖性核糖核酸酶L (RNase L) 是已知的限制干扰素处理细胞中病毒复制的细胞内酶，并且可以抑制异源基因的瞬时表达。PKR和RNase L对CHO细胞中rMAb瞬时表达的影响可能涉及类似的瞬时基因表达抑制。它们的存在可能会降低瞬时表达期间rMAb生产的效率。那么，在PKR敲除和/或RNase L敲除CHO细胞中，rMAb的瞬时表达可能会得到增强。 6.3. 腺苷脱氨酶对RNA 1在仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体瞬时表达的影响 信息表明，腺苷脱氨酶对RNA 1 (ADAR1) 的共表达可以在多种细胞系中增强基于质粒的基因表达。这种增强似乎与启动子类型、蛋白报告基因和细胞系无关。因此，合理推测CHO细胞中ADAR1的共表达也可能通过提高基因表达效率来增强rMAb的瞬时表达。然而，与任何实验操作一样，实际效果需要在CHO细胞中rMAb生产的特定环境中验证。 6.4. Bcl‑xL表达对重组单克隆抗体瞬时和稳定表达的影响 信息表明，Bcl-xL抗凋亡蛋白的瞬时表达可以延长细胞存活并保护细胞免受凋亡。虽然这种效应可能通过提高细胞活力来潜在增强rMAb的瞬时表达，但它不一定直接促进稳定表达。稳定表达涉及不同的机制，包括转基因整合到宿主细胞基因组中，这可能不会直接受到像Bcl-xL这样的抗凋亡因素的影响。需要进一步研究以评估Bcl-xL表达对rMAb瞬时和稳定表达的影响。 6.5. 蛋白二硫异构酶表达对重组单克隆抗体瞬时和稳定表达的影响 信息表明，PDI的瞬时过表达可以增加rMAb的分泌速率。与Bcl‑xL类似，PDI对稳定表达的影响可能因涉及的不同机制而不同。虽然PDI可能在瞬时表达期间潜在增强rMAb的分泌效率，但稳定表达依赖于各种因素，包括染色体整合和转基因表达的长期维持。需要额外的研究来确定PDI表达对CHO细胞中rMAb瞬时和稳定表达的影响。 6.6. 温度对仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体生产的影响 通过在CHO细胞中实施较低的温度，已经注意到rMAb瞬时生产的改善。相反，降低培养温度可能会增加稳定表达rMAb的CHO细胞中抗体聚集物的形成。调查瞬时和稳定表达之间差异的分子机制将是一项迷人的工作。 6.7. 合成5'-非翻译区对仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体生产的影响 通过涉及设计、筛选和优化5' UTRs的高通量策略，发现了三种增强CMV启动子蛋白表达的合成5'-UTR。这些合成5'-UTR对CHO细胞中rMAb生产的影响值得进一步研究。 6.8. 3'-非翻译区对仓鼠卵巢细胞中重组单克隆抗体生产的影响 除了5'帽子、5'-UTRs、编码区和聚腺苷酸尾巴之外，3'-UTR在减轻mRNA疫苗的免疫原性、确保mRNA疫苗的细胞内稳定性和翻译效率的一致改进中起着至关重要的作用。5'-UTR和下游的3'-UTR对mRNA疫苗的稳定性都有很大的贡献。因此，探索3'-UTR对CHO细胞中rMAb生产的影响是一个值得进一步研究的主题。 7.结论 事实上，自从CHO细胞问世以来，它们一直是科学研究和工业生产rMAb的首选，大约75%的相关科学出版物持续使用这些细胞。过去十年中这一稳定的百分比表明，CHO细胞可能会在可预见的未来继续在哺乳动物细胞培养中的蛋白表达中发挥关键作用。尽管它们有着悠久的历史，但持续的努力正致力于改进CHO细胞中rMAb的生产。 多个领域的进步正在促进CHO细胞中rMAb生产的持续改进。这些包括改进培养基配方以优化培养条件，开发更高效的表达载体以增强基因表达，以及探索旨在增加CHO细胞中rMAb表达水平的多种细胞工程技术。随着对rMAb的需求增长和应用多样化，研究和开发工作有望进一步推进基于CHO细胞的蛋白表达平台的能力和潜力。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。