PEP-1

关注并星标CPHI制药在线 透皮传递能将药物直接输送到血液中，有效克服口服、注射等传统给药方式的弊端，从而成为药物传递的一种重要方式。大多数药物并不具备强透皮能力，借助载体透皮成为主要的药物输送方式，因此具有透皮传导能力的透皮介导肽展示出了广阔的应用前景。 根据来源不同，透皮介导肽可分为3类：蛋白质来源的透皮介导肽、基因重组来源的透皮介导肽和人工设计合成的透皮介导肽。 1、蛋白质来源的透皮介导肽 蛋白质来源的透皮介导肽是由天然蛋白质或其片段衍生而来的短肽，这些肽具有独特的氨基酸序列和结构特性，使其能够穿透细胞膜，而且通常具有较低的免疫原性，不易引起免疫反应。 ①TAT-PTD是最早发现的细胞穿膜肽。研究发现人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的TAT蛋白可以被细胞跨膜摄取并转移到细胞核中。自然界中这类天然存在的多肽能够安全有效地实现外源生物大分子的跨膜转导，被称为蛋白质转导结构域（PTD）家族。TAT中含有一个与蛋白转导功能密切相关的多肽片段（富含碱性氨基酸且带正电荷），进一步研究证实，TAT中第47～57位的11个氨基酸残基（YGRKKRRQRRR）可独立穿过多种类型的细胞膜，穿膜效率比全长TAT还要高，于是此段肽链被归为TAT蛋白转导结构域（TAT-PTD）。TAT-PTD可递送双氯芬酸钠、热休克蛋白P20、人类酪氨酸酶质粒、盐酸利多卡因（LID）、降钙素和塞来昔布等药物进入皮肤，并发挥良好的治疗作用。 ②来源于果蝇触角蛋白异型的转录调节蛋白ANTP也是经典的细胞穿膜肽之一。ANTP由60个氨基酸序列组成，包含3个α-螺旋结构，其中第3螺旋结构中的16个氨基酸多肽片段（43～58位）在蛋白转导中发挥着关键作用。目前，ANTP已实现商品化，即Penetratin，Penetratin可有效增强卵清蛋白（OVA257～264、OVA8）的穿透皮肤表面能力，从而引发高水平的OVA 特异性CD8+T细胞应答。Penetratin 修饰的微乳能显著增加紫杉醇活性表皮层和真皮层的沉积量。 除了广泛应用的TAT-PTD和ANTP等细胞穿透肽，其它的一些来自于生物体的细胞穿透肽也被发现具有透皮能力。低分子量鱼精蛋白（LWMP）是天然鱼精蛋白通过酶消化产生的肽片段。LWMP成本低、易于批量生产，是目前研究比较广泛的细胞穿膜肽。LMWP 与 TAT-PTD 具有显著的结构相似性，其结构也有10个精氨酸残基，与TAT-PTD 的促渗机制也相似。LMWP与卵清蛋白结合后，可以显著提高卵清蛋白穿透皮肤的能力。LMWP 修饰的聚乙烯亚胺/DNA 复合物（PEI/DNA）纳米粒的皮肤累积透过量明显优于未修饰的 PEI/DNA纳米粒。此外，从家蚕的 30kc19蛋白中发现的 Pep-c19，人源蛋白中得到的 IMT-P8和来源于非洲爪蟾皮肤的蛙皮素，人类蛋白磷酸酶中发现的 Mgpe-9，从人类转录因子中鉴别出的Hph-1-PTD等蛋白质来源的细胞穿膜肽同样具有促进透皮吸收的作用。 2、基因重组来源的透皮介导肽 蛋白质转导结构域（PDT）为开发新型透皮介导肽提供了一种高效手段。它将外源肽的编码基因插入噬菌体（通常是M13、T4或 T7噬菌体）的外壳蛋白基因中，构建噬菌体展示文库。噬菌体展示文库可以包含大量不同的肽序列，增加筛选成功的可能性。基于PDT发现的透皮介导肽主要通过“生物淘洗法”得到。通常其流程是先将噬菌体颗粒应用到活体/离体皮肤上，再收集、扩增可以穿透皮肤的噬菌体，将这些可以穿透皮肤的噬菌体再次应用到皮肤上。经过几轮筛选后，通过穿透噬菌体的基因组 DNA 测序，鉴定可以持续穿透进入皮肤的肽序列。经筛选鉴定的肽通过透皮实验进一步评价其促渗效果。其优势主要体现在，可从数以亿计的氨基酸序列中筛选出目标肽透皮介导肽，实现高通量筛选。但是，找到高效穿透皮肤屏障的肽序列可能需要多轮筛选和优化，过程耗时较长。筛选得到的肽序列通常生物相容性较好，但在实际应用中仍需评估其潜在的免疫原性和毒性。 ①TD-1（ACSSSPSKHCG）是利用体内PDT筛选得到的具有11个氨基酸由二硫键成环的短肽，是第一个被报道能通过经皮给药途径有效携带蛋白质药物（胰岛素）的透皮介导肽。TD-1具有序列特异性和浓度依赖性，缺失其中的某些氨基酸都会降低透皮速率，并且随着 TD-1浓度的升高，透皮增强效果也随之提高。 ②SPACE肽和DLP是使用离体猪皮进行 PDT筛选所得，其可以同时增强大分子穿透表皮和真皮细胞膜活性。研究表明，这2个多肽在人体皮肤、小鼠皮肤、猪皮上均可实现高效穿透，其中关于SPACE肽研究开展的更加广泛，例如 siRNA、环孢素A、透明质酸等的递送。 此外，线性肽T2（LVGVFH）和七肽 DRTTLTN均能发挥促渗作用。 3、人工设计合成的透皮介导肽 人工设计合成的透皮介导肽是根据天然蛋白质和基因重组来源透皮介导肽的特点设计得到的新透皮介导肽。该方法不受限于天然肽或蛋白质的序列，可以探索新的序列组合和功能，提高创新性。较早发现的天然来源细胞穿膜肽（如 TAT、ANTP）的一个典型特征是其中含有高浓度的精氨酸或者其他碱性带正电的氨基酸。聚精氨酸（Rn）在进入细胞时比赖氨酸、鸟氨酸或组氨酸组成的类似长度聚合物更有效，这表明精氨酸在穿透细胞膜过程中起着重要的作用。 ①聚精氨酸（R7）应用到皮肤渗透研究中，可以提高环孢素A的跨皮肤转运。聚精氨酸的皮肤渗透深度取决于施用精氨酸的数量和浓度。比较不同数量精氨酸的序列增强纳米脂质载体促进皮肤渗透的能力发现，精氨酸数量从8增加到11时，皮肤渗透能力增强；精氨酸数量从1增加到15时，皮肤渗透能力降低，这被归因于精氨酸的长度导致的饱和效应或空间位阻。不过，不同药物可能需要不同长度的聚精氨酸。例如，R4显著提高三肽-1（甘氨酰-组氨酰-赖氨酸，GHK）的渗透率；R6连接免疫蛋白OVA 应用到雄性小鼠皮肤上，增强了抗原特异性抗体的诱导；TD-1与R8联用可促进 MITF-siRNA 皮肤渗透，显著抑制黑色素合成；R9 可提高绿色荧光蛋白（GFP）和胰岛素的皮肤渗透；R11 修饰的塞来昔布纳米结构脂质载体比未修饰载体有更高的透皮效率。此外，还有一些含有精氨酸残基的肽具有皮肤促渗作用，如 R5H3、R8H3等。 ②利用赖氨酸双取代TD-1的N-5和N-6位得到的TD-34（ACSSKKSKHCG）显示出良好的促渗活性。由于透皮介导肽容易被蛋白水解酶降解，近年来开发了多种增强透皮介导肽稳定性的方法。其中最稳定和可靠的方法是N-乙酰化和C-酰胺化。TDN（ACSSKKSKHCG-NH2）是在TD-1的 C末端酰胺化修饰获得的，TDN 的稳定性明显高于TD-1。将TD-34的 N-1和N-2氨基酸进行取代，且C末端进行酰胺化，合成线性肽DL-2（KWSSKKSKHCG-NH2）和环状肽DLCC-2（KCSSKKSKHCG-NH2）在皮肤中能维持相对稳定的有效透皮介导肽浓度，促进药物的皮肤吸收。 ③Pep-1是利用细胞穿膜肽的两亲特性设计的嵌合肽，该肽可将各种多肽和蛋白质以完全生物活性的形式有效地输送到几个细胞系中，无需与载荷蛋白进行化学共价连接或使载荷蛋白发生变性。Pep-1由富含色氨酸的疏水性氨基序列（KETWWETWWTEW）和富含赖氨酸亲水性结构域（KKKKV）以及分隔2个结构域的间隔区（WSQP）组成。Pep-1 可与肉毒杆菌神经毒素结合进入小鼠皮肤，有效渗透到表皮和真皮；Pep-1也可与超氧化物歧化酶（SOD）融合，转导到皮肤组织中，实现对缺血性脑损伤的有效治疗。 人工设计合成的透皮介导肽具有高度可定制化、无天然限制和精确控制等优点，使其在药物递送和生物医学应用中具有巨大潜力。然而在实际研发过程中，需要克服成本高、设计复杂性以及潜在的生物相容性问题等限制和不足。 促渗作用机制 目前关于透皮介导肽转导载荷进入细胞的机制研究存在着诸多矛盾之处。对已经报道的代表性透皮介导肽的研究发现，存在于它们之间的唯一共同特征是两亲性和带正电荷。在正常生理条件下，皮肤带负电荷，而皮肤真皮层和角质层也分别呈现亲水性和亲脂性差异。从皮肤特性来讲，两亲性和阳离子似乎也正是透皮所要求的基本条件。  ①表面正电荷属性推动透皮介导肽吸附到皮肤表面。对于透皮介导肽一级结构的分析证实了表面电荷对于透皮能力的影响。就自然属性和界面位置来看，正负电荷之间的相互作用是透皮介导肽进入皮肤的第一步，正负电荷相吸作用推动了透皮介导肽吸附到皮肤表面上来，且阳离子特性越强，接触面积越大，吸附性也越强。 ②透皮介导肽通过扰乱细胞间脂质结构或角蛋白结构透过角质层。角质层中不管是细胞内传递路径还是细胞间传递路径，由于存在着层间传递，即使亲水性物质也必须通过下一层的细胞间脂质，才能到达细胞内，因此细胞间脂质实际上就成为外来物质传递的主要限速结构。目前，大多数研究倾向于透皮介导肽通过扰乱细胞间脂质的有序结构而通过角质层，也有一些研究认为，透皮介导肽穿过细胞间脂质并不简单是由于脂质结合而导致的扰乱作用，而是认为透皮介导肽能够使角质层中角蛋白构象由β-折叠向α-螺旋转变，从而扰乱角蛋白结构，造成通透性。 ③精氨酸头部胍基主宰与真皮层细胞膜表面结合。透皮介导肽及其载荷穿过角质层后，在真皮层细胞中，共轭的载体肽和载荷药物穿过脂质细胞膜进入细胞质中，同角质层中细胞间脂质一样，膜脂结构也是入胞的主要障碍，精氨酸的胍基头部这时起到了重要作用。阳离子透皮介导肽中的精氨酸头部胍基是入胞的关键功能组分，细胞膜表面硫酸多糖在细胞表面形成电负性池，吸引带正电荷的精氨酸头部胍基，两者紧密结合；同时细胞膜的磷酸基团、硫酸基团与精氨酸残基的头部胍基基团形成配位氢键，促使胍基进一步结合到细胞膜表面。 ④胞吞作用使外界物质进入细胞内。多数研究者倾向于真皮层细胞通过胞吞作用摄取透皮介导肽及其载荷进入细胞内，而且受浓度、载荷种类、细胞类型等影响，对于阳离子透皮介导肽，巨细胞胞饮为主要细胞摄取形式。 ⑤细胞退出机制实现透皮介导肽及其载荷的逐层传递，最终到达真皮层。如果外界物质是通过进入细胞而实现传递，那就必然存在一个物质从细胞退出的机制，否则无法在真皮层以及血液中得到想要传递的物质。研究已经证实，细胞退出机制在透皮介导肽携带载荷传递中的作用。 ⑥皮肤物理属性等其它调控因素对于透皮的影响。除去细胞间途径和细胞内途径外，透皮介导肽传递的第3条途径皮肤附属器官通道对于传递机制也会产生一定的影响。一般认为皮肤厚度可能会影响透皮吸收效率，而对于肤厚度与经皮吸收之间的研究发现，皮肤厚度与不同动物经皮吸收能力之间并没有直接的关联，α-促黑激素（α-MSH）能够透过人和小鼠腹部皮肤，促进毛发和皮肤变黑，却难以透过大鼠皮肤，而人在某些部位的皮肤厚度与大鼠相当。由此表明不同透皮化合物对不同实验动物在经皮吸收方面存在着巨大的差异，很难由一种动物模型推断出另一种动物的吸收特性。 参考资料 [1]龚魁杰,石爱民,刘红芝,等.透皮介导肽及其经皮吸收机制研究进展[J].中国食品学报,2017,17(04):165-173. [2]黄钰卿,王宇岐,丁平田,等.透皮介导肽的研究进展[J].药物评价研究,2024,47(07):1653-1668. 作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。 END 【智药研习社直播预告】 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~