CpG-ODN(Guangdong Zhaotai InVivo Biomedicine)

摘要：疫苗是预防传染病最重要的工具之一。随着时间的推移，针对抗原成分开发了许多不同类型的疫苗。佐剂是提高疫苗实践效果的关键元素，通过多种不同的方式发挥作用，特别是作为载体、储存库和免疫反应的刺激物。多年来，疫苗中包含的佐剂很少，铝盐是最常用的佐剂。然而，最近的研究关注了许多具有有效佐剂特性和提高安全性的新化合物。现代技术如纳米技术和分子生物学已经有力地进入了抗原和佐剂成分的生产过程，从而提高了疫苗的效果。微粒、乳液和免疫刺激物因其在疫苗生产中的巨大潜力而备受关注。尽管有关疫苗佐剂的潜在副作用的研究已经报告，如最近认识到的ASIA综合征，但疫苗的巨大价值仍然不容置疑。事实上，最近的新冠大流行凸显了疫苗的重要性，特别是在管理未来潜在大流行方面。在这个领域，对佐剂的研究可能在生产越来越有效的疫苗中发挥领导作用。 1.引言 疫苗无疑是人类历史上最显著的健康成就之一。在两个多世纪的时间里，疫苗使我们能够实现诸如天花的彻底根除、世界上许多地区脊髓灰质炎的消失，以及多个国家许多传染病的死亡率和发病率的大幅下降等非凡目标。在世界许多地区，疫苗政策是公共卫生的基石，非常重视为人群保证安全有效的疫苗。疫苗的效果不仅取决于抗原成分，还取决于经常用来以更有效方式刺激免疫系统的佐剂。佐剂被定义为添加到疫苗中以改善对抗原的免疫反应的成分。此外，佐剂还有多种好处，如减少每剂疫苗中的抗原量和接种次数，在某些情况下，它们增加了抗原成分的稳定性，延长了其半衰期，间接提高了其免疫原性。现在有多种类型的佐剂可用于疫苗制造（表1）。 佐剂可以根据不同的标准进行分类，如它们的物理化学性质、来源和作用机制。最常遵循的分类系统之一是基于它们的作用机制，将它们分为两个主要类别：递送系统（颗粒状）和免疫增强剂。还有一类佐剂是粘膜佐剂，这是一组与前述佐剂共享一些特征的化合物。在递送系统佐剂中，抗原与作为抗原载体的佐剂相关联。此外，它们能够通过激活先天免疫系统来诱导局部炎症反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。具体来说，抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这导致先天免疫细胞的激活，产生细胞因子和趋化因子。免疫增强剂直接激活相同的途径（图1）。 图1. 佐剂的作用机制。 添加佐剂对于老年人使用的疫苗特别有用，因为这类受试者中发生的免疫衰老生理现象，这是导致自然感染或人工刺激（疫苗接种）后免疫反应减少的原因。在这种情况下，佐剂的存在可以代表一个有效的工具，以克服疫苗使用中的这一限制。此外，佐剂对于亚单位疫苗特别有用，因为它们通常太弱，无法单独刺激强大的免疫反应。然而，并非所有疫苗都需要佐剂。例如，许可的结合脑膜炎球菌疫苗不含有佐剂，因为与蛋白质载体的结合本身能够刺激良好的免疫反应。目前许可的佐剂疫苗列于表2。 正如表中所示，EMA和FDA目前许可用于人类使用的绝大多数疫苗都包含铝盐作为佐剂。这一点很重要，因为这些佐剂是疫苗配方中最古老的，并且增加新佐剂的数量显然是必要的，以提高疫苗的安全性和有效性。由于这些原因，加强具有佐剂特性的新分子和因素的研究，增加体外和体内研究的数量是至关重要的。同时，新产品的批准可能会因监管挑战而延迟和成本高昂，这些挑战涉及佐剂的使用和研究、新细胞基质的使用，或者申请流程变更或转移。这个方面可能代表一个阻碍创新、增加成本和延迟疫苗可用性的障碍，特别是在资源匮乏的国家。 此外，COVID-19大流行凸显了拥有有效疫苗的重要性，以应对新大流行的潜在威胁。事实上，许可的针对COVID-19的RNA疫苗具有与用作编码RNA载体的脂质体组分相关的内在佐剂特性。然而，最新许可的COVID-19疫苗是基于一个经典平台，包含刺突蛋白，并以添加一种名为Matrix-M的新佐剂为佐剂，该佐剂含有皂皮树Molina提取物的A部分和C部分。 在选择疫苗佐剂时，应考虑许多方面，其中安全性无疑是第一。一个好的佐剂必须首先是安全的、耐受性好的、易于生产的；具有良好的制药特性（pH值、渗透压、内毒素水平等）和持久的货架寿命；最后，经济上可行。在不影响佐剂安全性的情况下尊重所有这些特性是困难的。因此，目前使用的疫苗中包含的疫苗佐剂非常少。 尽管疫苗取得了巨大的成就，但近几十年来对这些产品产生了很多担忧。一种反对疫苗的文化，被称为“疫苗犹豫”，已经在全球传播。这在COVID-19大流行期间得到了鼓励，一方面，它强调了疫苗接种作为对抗传染病的重要武器的重要性，但另一方面，它也凸显了一部分人口的犹豫行为。已经报告了这种态度的多种原因，但许多研究表明，对副作用的恐惧和对疫苗成分的不信任是最常报告的。特别是，佐剂是比其它成分更容易引起公众担忧的成分。实际上，当存在时，疫苗的副作用通常是轻微和短暂的，通常表现为注射部位的局部疼痛和红斑、轻微的全身不适和类似流感的症状。这些效果通常在疫苗接种后几小时或几天内消失。很少有过敏性反应或其他严重副作用的报告。 本综述的目的是检验当前使用的疫苗佐剂，并评估有关新佐剂的特性及可能的未来用途的正在进行的研究，突出科学文献中关于潜在关注点和副作用的证据。 2.递送系统 2.1.矿物盐铝盐 铝盐的佐剂特性在20世纪20年代被发现，自1926年以来这些化合物一直被用作疫苗佐剂。最初考虑将添加到生长介质中的铝盐用于诱导破伤风和白喉抗原的沉淀，以帮助它们的纯化。然而，很快就发现这些铝沉淀的抗原比可溶性的抗原具有更强的免疫原性。因此，铝盐是使用时间最长且最常包含在疫苗中的佐剂，约有三分之一的当前许可疫苗含有铝。因此，铝盐在疫苗佐剂中是安全性测试最多的。 人类通过不同来源接触铝，尤其是食物和空气。铝主要通过消化道和呼吸道被人体吸收，随后扩散，然后是三步消除过程，尽管这从未完全完成。吸入的铝少于3%，摄入的铝少于1%在生物体内扩散。然而，通过污染食物的摄取是人体中可发现的95%的铝的来源。世界卫生组织（WHO）规定，通过食物摄取的铝的最大水平应为1毫克/公斤/天（成人60至70毫克/天）。最后，铝可能包含在肠外溶液中，因此可以通过注射传播，通过血液和各种体液隔室在体内扩散。在这种情况下，为了避免铝的积累，其在肠外溶液中的水平应小于25微克/升。 一旦被生物体吸收，铝就在体内组织中扩散。大部分金属随后储存在骨骼、肝脏、肺和神经系统中。在患有慢性肾脏病的人群中，铝不能被消除并随时间积累，特别是在骨骼和神经系统中。在这类患者中，高水平的铝可以沉积在大脑中，导致脑病。铝穿透大脑在一项体内实验中得到了精确量化，该实验在大鼠中注射同位素铝-26（26Al）后进行。在生理条件下，铝对大脑的穿透力从每克脑组织的0.001%到0.005%不等，与其给药途径和化学形式无关。2010年，Goullé等人使用结合了电感耦合等离子体和质谱检测的技术，在20名未接触过金属且未接受过含铝或其他微量矿物质治疗的已故患者的人体组织中量化了铝的水平。以湿重表示的中值结果如下：肺=0.47微克/克，大脑=0.19微克/克，肝脏=0.15微克/克，心脏=0.10微克/克，肌肉=0.08微克/克，肾脏=0.06微克/克。 铝被生物体缓慢排泄，主要通过泌尿系统。一些铝永久沉积在人体中，随着接触水平和年龄的增长而增加。这种永久沉积的铝量在成人中估计为30至50毫克。 在疫苗中，铝以晶体状的氢氧化铝（AlH）或无定形的磷酸铝（AlP）的复合聚合物形式存在，形成聚集的纳米颗粒。AlH呈针状纳米颗粒（直径20纳米），而AlP在透射电子显微镜下呈网状。两种形式通常都溶于柠檬酸，但AlP比AlH更易溶。抗原通过静电相互作用和配体交换吸附在佐剂颗粒表面。铝盐/抗原结合增强了抗原呈递细胞（APCs）的抗原摄取和呈递。此外，铝盐刺激NLRP3炎症体的激活，导致IL-1β和IL-18的产生，随后局部炎症和APCs的招募。 许多疫苗使用吸附在AlH或AlP上的抗原（例如，针对破伤风和白喉、无细胞百日咳、乙型肝炎以及肺炎球菌和脑膜炎球菌疫苗），因为它们免疫原性差，随后需要增强免疫反应以引起有效的疫苗接种。在欧洲，疫苗中的铝量由欧洲药典设定为每剂最大1.25毫克铝。在美国，美国联邦法规将生物制品（包括疫苗）中的铝量设定为0.85毫克/剂。与主要以可溶性柠檬酸盐或氯化物形式存在于食物中的铝相比，用作佐剂的无机铝化合物溶解度差；这是它们佐剂作用的一部分。因此，由于在生理pH值下溶解度差，预期肌肉内或皮下注射疫苗中的铝的吸收率会非常慢。 为了评估肌肉内注射后铝的动力学，已经进行了一些体内研究。Flarend等人进行的一项实验研究基于肌肉内注射标记有26Al的AlH和AlP，铝的总剂量为0.85毫克，显示了28天内AlH的吸收率为17%，AlP的吸收率为51%。26Al的最大血清浓度（Cmax）增加为2微克/升，即正常值（30微克/升）的7%。基于这些结果，可以评估肌肉内注射铝盐疫苗佐剂后预期的铝Cmax增加，将等于0.04微克/升，即平均血液中铝水平5微克/升的0.8%。在这个实验中，还评估了大脑中的铝水平，浓度在10-8至10-7毫克/克之间，即10-5至10-4微克/克，因此<0.0001微克/克；这比人脑中平均浓度0.2微克/克低2000多倍。此外，一些研究评估了人类注射26Al-citrate后的铝排泄。一项相当旧的研究表明，在静脉注射26Al-citrate后，59%的注射剂量在一天内通过尿液排出，随后几天排泄速度较慢（第5天的平均保留率为27%），而一项较新的研究表明，在注射铝剂量8年后，保留率约为2%。 铝的毒性是由于体内液体和组织中金属水平的增加。这种增加尤其是由于消除能力的改变，特别是当肾功能受损时。接受血液透析的肾功能衰竭患者尤其有更高风险的铝水平和可能的神经毒性。肾脏移植能够解决铝过剩问题，可能还有相关的神经毒性。多年来，科学家一直在辩论铝神经毒性作为神经退行性疾病原因的可能角色，即使到目前为止，没有确切的证据显示，这个角色仍然是有争议的。 铝的神经毒性已在体外、离体和体内动物模型以及人类中进行了研究。一些体外研究在细菌上进行，显示没有致突变性。此外，使用对氧化突变原敏感的菌株，对铝的氧化作用模式产生了怀疑。其他体外研究在细胞系上进行，以评估不同形式的铝的可能遗传毒性。一些科学家致力于离体研究，使用来自多个供体的淋巴细胞，动物模型中的胚胎毒性研究，最后是各种体内研究。在所有这些研究中，最常用的技术是彗星试验和微核试验。值得注意的是，结果往往是不一致和矛盾的，可能存在方法上的缺陷。因此，到目前为止，尚不可能肯定地说，用作佐剂的铝盐（在推荐剂量下）可能具有毒性效应，尽管它们能够产生或多或少的强烈氧化应激。 2.2.乳液 这一类重要佐剂的始祖是完全和不完全弗氏佐剂。这两种佐剂都是水包油乳液，能够携带抗原并刺激先天免疫系统。完全弗氏佐剂（CFA）在其结构中包含热杀死的结核菌，这增强了对免疫反应的刺激，目前用于体内实验以在小鼠中诱导强烈的免疫激活和自身免疫（如葡萄膜炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎）。然而，CFA能够引起强烈、持久的局部炎症，可能导致动物显著疼痛，并可能在注射部位出现溃疡。不完全弗氏佐剂（IFA）不含结核菌，20世纪50年代作为人类流感疫苗的佐剂使用；与没有佐剂的相同疫苗相比，它能诱导更强、更持久的抗体反应。IFA的佐剂活性基于其作为油性抗原沉积的特性，从注射部位持续释放抗原。这同时增加了抗原的寿命，并强烈刺激局部先天免疫系统，伴有吞噬作用、白细胞的募集和浸润以及细胞因子的产生。然而，IFA在疫苗配方中的引入及其在人类中的常规使用受到其引起的强烈副作用的阻碍。特别是，由高剂量不可生物降解的油脂以及它们的质量差引起的毒性。2005年世界卫生组织进行的一项调查显示，大约一百万人使用IFA进行免疫接种，其中4万人出现了严重的副作用，如无菌脓肿。 2.2.1.MF59 MF59是一种水包油乳液，由角鲨烯、Span 85和Tween 80在pH 6.5的10 mM柠檬酸钠缓冲液中组成，平均粒径约为165纳米。这是第一个作为佐剂批准用于人类疫苗使用的水包油乳液，于1997年在意大利获批。目前，它包含在佐剂化的三价和四价（TIV和QIV）流感疫苗Fluad（Seqirus）中，最初只用于65岁以上的人群，但后来被批准用于其他流感风险群体，如幼儿和婴儿，在H1N1大流行疫苗期间，还批准用于孕妇和幼儿。已经证明，MF59的存在增加了流感疫苗在2岁以下儿童中的有效性。MF59还在乙肝疫苗中作为佐剂进行了测试，能够触发令人印象深刻的免疫反应，比铝佐剂诱导的反应更好。关于作用机制，MF59具有与铝盐相似的效果。在注射部位的沉积活性相当小，因为研究表明其半衰期为42小时。相反，MF59具有强大的能力，能够诱导细胞和体液免疫反应，包括产生高滴度的功能性抗体。MF59的存在刺激局部先天免疫细胞分泌趋化因子，如C-C基序趋化因子配体4（CCL4）、C-C基序趋化因子配体25（CCL2）、C-C基序趋化因子配体5（CCL5）和C-X-C基序配体8（CXCL8），这些趋化因子反过来驱动白细胞的募集、抗原的摄取和迁移到淋巴结，并触发适应性免疫反应。此外，有研究报告称，MF59能够增加调节白细胞跨内皮迁移的基因簇的表达，并随后招募MHCII+CD11b+细胞到注射部位，引发强烈的免疫反应。MF59安全且耐受性良好，这一点已通过在超过35个国家接种的数百万剂次证明。 2.2.2.AS03 AS03是一种水包油佐剂乳液，由表面活性剂聚山梨醇酯80和两种可生物降解的油脂组成，即角鲨烯和DL-α-生育酚在磷酸盐缓冲液中。这种佐剂已用于流感疫苗，诱导与MF59类似的免疫反应，以及在疟疾疫苗中。欧洲委员会于2009年授权AS03佐剂疫苗Pandemrix上市，而AS03佐剂的流感A（H5N1）单价疫苗于2013年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。然而，α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性似乎比MF59增强了免疫刺激。事实上，在6至35个月大的儿童中使用AS03佐剂流感疫苗，即使在接种后6个月，也显示出强烈的免疫反应。为了阐明DL-α-生育酚在AS03中的贡献，进行了一些研究，比较了AS03和缺乏DL-α-生育酚的相似乳液的效果。通过测量抗原摄取、免疫细胞募集和分泌的细胞因子水平，得出结论，缺乏DL-α-生育酚导致了较低的免疫反应和较低的抗体滴度。此外，已经显示AS03能够通过激活NF-κB来刺激免疫系统，这在肌肉和淋巴结中诱导细胞因子和趋化因子的分泌，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03可以刺激CD4+ T细胞特异性免疫反应，这可以决定持久的中和抗体产生和更高水平的记忆B细胞。AS03的成分进一步补充了两种强大的免疫刺激剂，QS-21（从皂皮树中提取的皂苷）和3-O-去酰基-40-单磷脂A（MPL），以增强其免疫原性，产生了AS02。 2.3.微粒 2.3.1.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是二十面体或杆状纳米颗粒（直径20-200纳米），由自组装的衣壳蛋白组成；长期以来，它们已被研究并用于疫苗开发。它们是非传染性颗粒，因为它们不包含任何遗传物质。它们是一类新疫苗（称为纳米疫苗）中最重要的代表之一，在疫苗开发中变得越来越重要。VLPs是智能纳米颗粒，因为它们由外部病毒壳层和重复表位组成，这些表位被免疫系统立即识别为非自身，产生强烈的免疫反应。这一特性与自然病毒共享，但并不伴有引起感染的有害能力。除了这些重复的结构基序外，VLPs在大小上与病毒相似（通常在20-800纳米之间），并经历了快速有效的处理，导致快速且持久的免疫反应的产生，即使在没有佐剂的情况下也是如此。VLPs可以根据有无包膜被分类为非包膜VLPs和包膜VLPs（eVLPs）。非包膜VLPs可以进一步分为单个或多个衣壳蛋白VLPs，以及单层、双层和三层VLPs。由乳头瘤病毒L1和L2蛋白形成的多衣壳非包膜VLPs是一个经典的例子，它们能够自组装形成微粒。eVLPs在组装和出芽过程中从宿主细胞获得其脂质膜。它们也分为单层、双层和多层。它们可以通过使用各种细胞系统的不同病毒类型通过不同的技术制造，其中包括大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞和无细胞系统。在细胞系统中制造VLPs采用一种称为“先组装后纯化”的多步骤方法，第一步利用衣壳蛋白在表达细胞载体内直接发生的自发组装能力。下一步包括新形成颗粒的纯化。有时，为了获得纯化的颗粒，在细胞组装后，需要解聚新颗粒，因此需要第二次重新组装它们。另一种制造方法使用无细胞体外组装处理系统，包括传统细胞方法的逆转。特别是，使用体外系统作为平台，在表达和纯化衣壳蛋白后诱导其自发组装，无需解聚新形成的VLPs。 目前，两种重要的佐剂疫苗使用纳米颗粒平台来诱导免疫：乙型肝炎和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。目前使用的乙型肝炎疫苗是一种含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的重组DNA疫苗，以VLPs的形式存在，用于预防乙型肝炎感染，并通过使用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA技术生产。每剂含有10微克/0.5毫升的VLPs（儿童剂量）或20微克/毫升（成人剂量），两者都吸附在氢氧化铝水合物上。该疫苗接种给婴儿、儿童和15岁以下的青少年，或在有高风险感染乙型肝炎的群体中，也显示出在乙型肝炎携带者母亲所生的新生儿中有出色的免疫原性（95-99%的有效性）。乙型肝炎疫苗似乎至少能提供10年的免疫力。 HPV疫苗也是基于VLP平台的疫苗。HPV病毒是非包膜的，包含双链DNA（dsDNA）。衣壳具有二十面体对称性，由主要和次要结构蛋白组成，即L1和L2蛋白。目前的九价HPV疫苗可预防九种不同的病毒基因型，这些基因型负责90%的宫颈癌和80-95%的生殖器癌症，建议从9岁开始对男性和女性都进行接种。九价HPV疫苗包含九种不同基因型的HPV（6, 11, 16, 18, 31, 45, 53, 58）的L1蛋白形成的VLPs，并通过重组DNA技术合成。VLPs的优势在于它们是不含病毒基因组的蛋白结构，是非传染性和非致癌性的。目前用于表达L1蛋白的载体是酿酒酵母。VLPs与佐剂（AlP）的结合使用允许出色的免疫反应，因此除了能够保护新生儿免受HPV 6和11的感染外，还能提供90%的宫颈癌保护。 2.3.2.病毒体 病毒体是一种与天然病毒结构非常相似的疫苗平台。在结构上，它们是由重组流感病毒包膜形成的VLPs，包含血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和磷脂（磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱），缺乏病毒遗传物质。1975年首次提出使用病毒体制造流感疫苗。自那以后，关于这种疫苗有效性的科学证据已经出现，同时有两种疫苗用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。Inflexal V是一种适合所有年龄组的佐剂流感疫苗，在健康和免疫功能低下的儿童、成人和老年人中都具有良好的疗效。它能够诱导B细胞反应并产生特异性抗体。病毒体保留了病毒HA的受体结合能力和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，它们在结合后无法在细胞中诱导感染。此外，这种结合能力使它们的免疫原性比亚单位和分裂病毒流感疫苗更高。病毒体作为一个完美的递送系统，能够将抗原转移到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。然而，由于它们的佐剂特性较弱，病毒体在激活APCs和促进交叉呈递方面效率不高。这种固有限制可以通过添加更强的佐剂来消除。例如，最近开发了一种新型基于病毒体的流感疫苗，该疫苗补充了Toll样受体4（TLR4）配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni吸附到膜中。体外实验表明，吸附了MPLA的病毒体能够比没有添加佐剂的病毒体更强地激活APCs。此外，用这些MPLA佐剂病毒体对小鼠进行体内免疫接种，结果诱导了特异性CTLs。 流感病毒体的制造包括使用洗涤剂八(乙二醇)-n-十二烷基单醚（C12E8）溶解病毒包膜，随后进行超速离心和去除病毒核衣壳。然后，使用疏水珠从上清液中去除洗涤剂，随后病毒膜脂质和包膜糖蛋白重新组装形成大约100-200纳米的颗粒。已经证明，这个过程能够生产出与野生型病毒融合特性非常相似的流感病毒体。流感病毒体通过受体介导的内吞作用进入细胞，然后与内体膜融合。不同的大分子可以封装在病毒体腔内，由于膜融合活性，能够到达目标细胞的细胞质。例如，已经证明，封装在病毒体中的DTA（白喉毒素的A亚单位）可以成功地运输到目标细胞的细胞质中，导致蛋白质合成的完全抑制。甚至质粒DNA也可以封装在由阳离子脂质形成的病毒体中。这种病毒体DNA可以用来有效地转染目标细胞。 病毒体递送系统和佐剂的显著优势在于它们能够通过疏水脂质相互作用将抗原吸附到它们的表面和腔室上。此外，与VLPs相比，病毒体在疫苗生产中更受青睐，因为后者由于其基于蛋白的结构而具有更有限的运动。此外，将抗原吸附到病毒体流动的磷脂双层表面刺激与宿主细胞受体的相互作用。FDA已经批准病毒体作为人类使用的纳米载体，因为它们具有非常高的耐受性和安全性。与亚单位疫苗相比，病毒体能够诱导强大的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂非常相似。 迄今为止，除了上述两种基于病毒体的流感和甲型肝炎疫苗外，还有几种基于病毒体的疫苗正在研究中，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。HIV病毒体疫苗在临床第一阶段显示出可接受的结果，可能很快就会上市。尽管疫苗可以通过肌肉内或皮下途径给药，但粘膜途径可能会引发更强的免疫反应，因为HIV传播的主要途径是通过粘膜组织。因此，强烈的粘膜抗体产生是抵御HIV感染的重要防御机制。一种基于HIV的病毒体疫苗是通过吸附一些HIV-1毒力抗原（如gp41和p1肽）并包括佐剂3M-052（一种增加病毒体膜刚性的热稳定佐剂）从流感病毒中制备的。在另一项研究中，一种热稳定的HIV-1病毒体疫苗由带有HA、NA、卵磷脂、脑磷脂和其他磷脂的流感病毒体组成，另外还包括3M-052、Toll样受体（TLR7/8）和糖分子海藻糖。 关于HPV，一些研究关注了基于病毒体的疫苗的效力，这些疫苗包含通过受体介导的内吞作用与宿主细胞膜融合的E6和E7蛋白。研究表明，重组HPV16 E7流感病毒体诱导了强烈的CTL反应，并防止了HPV16+转化癌症的发展。此外，用E7-病毒体免疫接种诱导了针对E7的IgG抗体反应。 3.免疫增强剂 3.1.TLR1/2激动剂 在TLR1/2激动剂中，L-pampo是一种强大的佐剂系统，由Pam3Csk4（Pam3）和多聚肌苷酸：多聚胞苷酸（polyI:C）组成，分别是强大的TLR1/2和TLR3激动剂。在Lee等人的研究中，L-pampo诱导了比氢氧化铝更强的针对HBV的抗体产生，并且还涉及细胞介导的免疫反应，如增加多功能CD4+ T细胞。此外，L-pampo也被研究作为针对SARS-CoV-2的强效佐剂。具体来说，SARS-CoV-2抗原（如受体结合域（RBD）和S1抗原或与L-pampo结合的RBD-Fc）刺激了比广泛使用的佐剂更强的针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫反应。 此外，细菌脂蛋白是TLR2识别的最强效的配体。已经表明，源自细菌脂蛋白的合成脂肽是B细胞和巨噬细胞的强激活剂，可以用作疫苗佐剂。来自发酵支原体的2 kDa巨噬细胞激活脂肽-2 (MALP-2) 通过TLR2-和MyD88依赖的信号传导途径激活免疫细胞。除了MALP-2，Pam2CSK4和Pam3CSK4是公认的TLR2激动剂，它们已被评估为针对利什曼病、疟疾和流感等传染病的治疗剂。 TLR3激动剂 在TLRs发现之前，合成的双链RNA polyriboisosinic:polyribocytidylic acid [poly(I:C)] 被发现具有很强的诱导IFN产生的能力。TLR3，一个检测病毒双链RNA的内质体受体，识别poly(I:C)，因为它在结构上模仿病毒RNA，从而诱导I型IFN和III型IFN的产生，并引发Th1细胞因子反应。由TLR3-poly(I:C)相互作用产生的I型IFN对于传统的树突状细胞(cDCs)有效地激活CD8 T细胞反应尤为重要。此外，poly(I:C)产生的I型IFN刺激T细胞的克隆扩增，增加效应T细胞的比例和抗原特异性B细胞的数量。基于所有这些原因，poly(I:C)已被广泛研究作为潜在的佐剂。然而，poly(I:C)对人类具有毒性。因此，科学家们的关注集中在poly(I:C)的衍生物上，如poly(ICLC)和poly(IC12U)，以及其他合成TLR3激动剂，如ARNAX、IPH 3102和RGC100。poly(ICLC)是聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，与poly(I:C)类似，能够刺激IFN的产生。然而，它对血清核酸酶表现出更高的抵抗力，同时具有更高的免疫刺激性。poly(ICLC)的一个有趣方面是其能够诱导先天免疫途径中其他几个遗传序列的表达，包括炎症体和补体系统，类似于活病毒疫苗。迄今为止，一些研究已将poly(ICLC)作为针对疟疾、HIV和癌症的疫苗候选物。已经表明，与其他TLR激动剂如LPS和CpG相比，poly(ICLC)能够引发更强的Th1免疫反应，这在疫苗接种中是一个积极方面。poly(IC12U)旨在通过尿嘧啶和鸟苷残基之间的不匹配来降低poly(I:C)的毒性。然而，尽管这种变化降低了毒性，但它产生的I型IFN比poly(I:C)少。与poly(I:C)和poly(ICLC)不同，已经表明poly(IC12U)能够结合TLR3但不结合MDA5。与poly(ICLC)类似，一些研究已将poly(IC12U)作为针对HIV、流感和癌症的疫苗中的佐剂。具有佐剂潜力的新型TLR3激动剂ARNAX是一种特异于TLR3的配体，特别生产出来以降低比poly(I:C)更低的毒性。poly(I:C)的毒性与其激活MAVS途径(激活RIG-I和/或MDA5)的能力有关。因此，Matsumoto等人开发了一种配体，包括GpC磷酸硫代寡脱氧核苷酸和双链RNA，该配体被TLR3识别并内化为内质体。该配体能够在不被MDA5检测的情况下激活TLR3，这是由于RNA链的相对较短长度。在小鼠模型中，该佐剂未能显著增加血清炎症细胞因子水平，但有利于DCs对抗原的交叉呈递，并引发Th1型反应。ARNAX研究的两个最重要领域是癌症免疫治疗和流感疫苗接种。 3.2.TLR4激动剂 作为疫苗佐剂研究的TLR4激动剂是AS01、AS02和AS04，它们都含有MPLA，即内质体TLR4的配体。具体来说，AS01已被用于开发针对疟疾、HIV和结核病的疫苗。AS01是一种结合佐剂系统，由MPLA和QS-21两种不同的免疫刺激性分子组成，它们被封装在脂质体结构中。QS-21是从皂皮树Molina的树皮中提取的天然三萜皂苷。这两种化合物使用脂质体作为载体，通过胆固醇依赖性内吞作用到达细胞。在细胞内，QS-21导致溶酶体不稳定，并促进蛋白激酶SYK的激活。MPLA连接内质体TLR4，诱导TRIF依赖性信号传导途径。单独使用QS-21具有重要且不利的溶血效应，诱导细胞死亡。然而，QS-21的溶血活性和随后的细胞死亡通过封装在脂质体中被消除。AS01激活caspase-1，从而促进NLRP3炎症体激活和APCs释放IL-1β以及IL-18。IL-18的释放导致IFN-γ的快速产生，特别是通过淋巴结中的自然杀伤细胞，从而促进DCs的成熟和Th1型免疫反应的诱导。 3.3.TLR5激动剂 TLR5是识别细菌鞭毛蛋白的受体，由多种免疫细胞表达。与配体的联系导致炎症途径的激活和许多炎症介质的释放，如TNF-α、IL-1β、IL-6和一氧化氮。此外，鞭毛蛋白能够引发Th1和Th2反应，与其他只能主要诱导Th1反应的TLR配体不同。此外，鞭毛蛋白通过激活NLRC4炎症体诱导IL-1β的产生和释放。鞭毛蛋白能够在TLR5或NLRC4非依赖模型中发挥佐剂活性，但效率低于野生型。事实上，当小鼠模型中两个受体都不出现时，佐剂能力大大降低，这表明至少需要一个受体来驱动免疫反应；两者的存在提供了最佳的免疫结果。已经表明，鞭毛蛋白在免疫功能低下的人中保持其佐剂能力，例如在HIV+患者中。Cui等人回顾了所有使用鞭毛蛋白作为佐剂的研究。最简单的方法是将其与抗原一起给药；这种简单的方法成功地诱导了对抗呼吸和胃肠道感染至关重要的粘膜免疫反应。已经进行了许多研究，特别是关于鞭毛蛋白作为流感疫苗佐剂的作用。在这些研究中，使用了与不同流感抗原结合的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白，其中包括灭活PR8流感病毒(IPR8)、HA(H5N1)和禽流感病毒(AIV) H5N1，对于每一种抗原，都获得了强大的免疫反应（特别是粘膜IgA产生）。鞭毛蛋白还可以成功地修改以获得嵌合鞭毛蛋白或与活性减弱细菌如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌和肠产毒性大肠杆菌(ETEC)中的抗原鞭毛蛋白复合物。此外，重组鞭毛蛋白-抗原融合蛋白的生产已在动物模型中作为佐剂疫苗用于传染病和癌症。迄今为止，至少有三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗处于临床试验阶段：两种针对流感病毒，一种针对鼠疫杆菌。 3.4.TLR7/8激动剂 一些研究表明，TLR7/8激动剂能够强烈诱导Th1免疫反应。配体与TLR7/8结合产生高水平的I型IFN、IL-12、TNF-α和IL-1β。此外，TLR7/8和TLR9激动剂是唯一能够激活并促进cDCs和浆细胞样树突状细胞(pDCs)克隆扩增的激动剂分子，同时动员CD14+CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。最重要的代表性TLR7/8激动剂是一些名为伊马替莫德(R837)和雷西莫德(R848)的合成小分子，它们属于咪唑喹啉类。伊马替莫德目前已获批准并许可用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和角化病，而雷西莫德已研究其抗病毒和抗癌治疗用途。 然而，这些小分子已被证明具有一些固有的局限性。特别是，它们可以从给药部位扩散开来，远离抗原，从而降低效果并引起全身副作用。因此，已经表明将这些分子直接结合到铝佐剂上能够提高疫苗的效力。一些先前的研究将咪唑喹啉类直接结合到HIV-1 Gag蛋白或整个灭活的流感病毒上，增加了Th1反应和抗原特异性T细胞的数量。此外，与合成聚合物支架、脂质-聚合物两亲物、聚乙二醇(PEG)、纳米凝胶、明矾和各种其他合成聚合物的结合显著增加了咪唑喹啉的传递，并改善了树突状细胞的成熟和抗原特异性T细胞。此外，先前使用咪唑喹啉与一种或多种其他TLR激动剂（如MPLA（TLR4）和MPLA + CpG ODN（TLR4和TLR9））混合的研究显示，这种组合增加了先天免疫反应，显著产生抗原特异性中和抗体并改善Th1反应。所有这些创新方面都突出了TLR7/8激动剂作为佐剂候选物的极好潜力。 3.5.TLR9激动剂 TLR9自然识别由未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸代表的细菌DNA基序，通过MyD88依赖途径驱动先天免疫系统的激活。这些分子基序已被用作具有特定修饰的合成佐剂，以防止被核酸酶降解。CpG-ODNs在自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDCs)中引起强烈的化学因子、细胞因子和抗体产生，推动强烈的Th1型免疫反应。迄今为止，已经开发了属于三个类别（A-C）的三种不同类型的CpG-ODN配体，但只有属于类别B的分子已在临床试验中用作佐剂。CpG-B ODN定位于内质体并引起pDCs的成熟。此外，CpG-B ODN可以直接与B细胞相互作用以增强抗体产生。在小鼠模型中已经表明，作为佐剂的CpG-B ODN引起了相当持久的抗体产生，比铝佐剂或无佐剂疫苗更好。最近许可的CpG 1018，一种具有高化学稳定性和佐剂能力的寡核苷酸，能够引发Th1型免疫反应，用作乙肝疫苗Hepli-Sav-B中的佐剂。在Hepli-Sav-B中，CpG 1018提高了疫苗效力，只需要两剂的接种计划，相比之下传统乙肝疫苗需要三剂才能获得最佳保护。迄今为止，CpG 1018正在研究开发多种疫苗，包括针对黑色素瘤和COVID-19的疫苗。另一种CpG ODN，CpG 7909，也在临床评估中，并在HBV和疟疾疫苗接种中显示出令人鼓舞的结果。还开发了其他下一代TLR9激动剂。一个有效的代表是MGN1703，一种包含CG基序的小DNA分子，但其结构与CpG ODN不同。MGN1703由一段反向互补的DNA组成，中间是双链的，两侧是两个单链环，包括三个未甲基化的CG基序，形成一个哑铃形结构，与线性分子的CpG ODN形成对比。MGN1703已作为疫苗中的佐剂进行了测试，发现它能够激活先天和适应性免疫反应，副作用轻微或暂时。 4.佐剂的潜在副作用：ASIA综合征 尽管疫苗的安全性极佳，但近年来，人们对其可能的负面效应产生了新的关注，并在众所周知的上述副作用之外，描述了一种新的疾病实体。该实体是由佐剂引起的自身免疫/炎症综合征(ASIA)，首先由Shoenfeld等人提出。这种综合征包括一些免疫介导的疾病，很可能在遗传易感个体接触佐剂后发生。这种综合征的特征主要是产生自身抗体，并且一旦移除触发因素就会改善。在这种综合征的发作初期，一些外部因素，如感染性病原体或佐剂（例如尘埃、硅胶、铝盐等），作用于由特定HLA抗原介导的易发遗传背景，与自身免疫疾病(ADI)的发展相关。特别是，HLA-DRB1和PTPN22基因的同时存在已被证明是这些患者中最常见的自身免疫背景。根据最近的科学证据，一些病理状况，如结节病、Sjögren综合征(SS)、未分化结缔组织病(UCTD)、硅胶植入物不兼容综合征(SIIS)和免疫相关不良事件(irAEs)是ASIA综合征背景下的典型例子。除了疫苗中常见的佐剂外，许多其他物质如硅胶、石蜡、透明质酸、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯也显示出佐剂特性。 根据Watad等人的说法，有两种类型的标准可以帮助诊断ASIA，分为主要和次要标准。主要标准包括在临床表现之前接触各种外源性刺激（感染、接触佐剂）以及出现典型的临床表现，如肌痛、肌炎、关节痛、关节炎、慢性疲劳、睡眠障碍、脱髓鞘、记忆丧失、发热和口干。次要标准包括自身抗体或针对佐剂的抗体的出现、特定HLA模式的存在（例如，HLA DRB1、HLA DQB1）以及自身免疫疾病的发展，即多发性硬化症或系统性硬化症。 一些先前的研究报告称，含有铝盐的疫苗有能力引发ASIA的发作。一个例子是由四价HPV疫苗（含铝盐）代表的，据报道在接种后几周内增加了易感个体自身免疫的风险，或乙肝疫苗。然而，Linneberg的一项重要研究关于铝盐的潜在副作用表明，接受皮下过敏免疫疗法的人多次接种含有氢氧化铝作为佐剂的过敏原，然后接受的铝量比三剂疫苗中包含的量高出约100倍，死亡率较低，并且比接受常规过敏疗法的对照组发展出更少的自身免疫疾病。科学家们的努力转向研究生物标志物以诊断ASIA或预测其易感性（除了前面已经提到的）。例如，ACE 1和IL-2受体在患有这种综合征的个体中增加了50%，维生素D的缺乏增加了ASIA的发病率（由于缺乏免疫调节效应）。强调易感性在ASIA的发作中似乎非常相关是很重要的，Watad等人通过分析500例ASIA综合征的病例很好地突出了这一点。这项研究表明，更高比例的女性个体、吸烟者以及那些以前有自身免疫疾病或家庭成员受影响的人患有ASIA。多基因自身免疫疾病在这些疾病中最常见，UCTD和Sjögren综合征的患病率最高，分别为38.8%和16.8%。在54.4%的自身抗体检测阳性的患者中，有48.2%是ANA阳性。考虑到自身免疫/炎症状态的发展背后有环境和遗传因素，这是显而易见的。暴露于疫苗接种和症状发作之间的中位时间为一周（2天至5年）；48.2%的人口在至少接触一次疫苗后出现临床症状。然而，除了这些科学证据外，一些研究显示接种佐剂疫苗和ASIA综合征之间没有关系。在这些研究中，已经表明疫苗接种和自身免疫之间的关联可能是由于混杂因素的存在和随机事件的结果，而不是真正的因果关系。疫苗接种或接触外来物质与潜在的自身免疫/炎症和免疫介导事件之间的可能联系不应该是降低疫苗接种覆盖率的“假神话”。 疫苗不良事件确实非常罕见。由于缺乏信息和强有力的数据，ASIA是一个恰当的总括术语，用来汇集与疫苗、硅胶或其他外来物质暴露作为共同根源的事件和表面上无关的反应。重要的是要强调，即使未来的研究显示佐剂和自身免疫之间存在真正的相关性，这也不会减少疫苗免疫实践所发挥的巨大且无可置疑的保护作用，它们提供了许多临床益处；事实上，疫苗已经有助于根除和控制许多可传播疾病，改善了人类生活质量。 5.结论 疫苗接种一直是并将继续是人类对抗传染病最有力的武器之一。多亏了这些有效且安全的预防工具，人类已经能够从世界许多地区根除人类历史上最可怕的敌人。最近COVID-19大流行很好地突出了疫苗接种的重要性，疫苗研究必须取得进一步进展，为未来的大流行做准备。疫苗的效果基于佐剂的基本属性和贡献。关于疫苗接种的未来，必须更加关注这些分子，以生产越来越安全有效的疫苗。这一领域的研究正在进行中，并且有几种产品正在研究中，以实现这一目标，造福人类。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要：流感病毒是最重要的人畜共患病原体之一，能够引起严重症状，有潜力造成大量死亡和巨大的经济损失。疫苗接种仍然是预防流感病毒感染的最佳选择。已经开发了不同类型的流感疫苗，包括减毒活病毒疫苗、灭活全病毒疫苗、病毒体疫苗、裂解病毒疫苗和亚单位疫苗。然而，它们存在一些限制，如相对较高的制造成本和长时间的生产周期，某些疫苗在特定人群中的中等效力，以及缺乏交叉反应性。这些问题是需要解决的。在这里，我们总结了不同类型流感疫苗开发和应用的最新进展，包括病毒载体流感疫苗的最新发展。我们还描述了基于重组流感病毒作为病毒载体的其他疫苗的构建。本综述文章提供的信息可能会促进安全高效新型流感疫苗的开发。 1.引言 流感病毒是一种包膜RNA病毒，其病毒基因组由8个节段的负义单链RNA组成，编码10种核心蛋白，包括聚合酶基础2（PB2）、聚合酶基础1（PB1）、聚合酶酸性（PA）、血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M1和M2）以及非结构蛋白（NS1和NS2），以及其他一些功能性辅助蛋白，如聚合酶基础1-F2（PB1-F2）、聚合酶基础1 N40（PB1N40）、聚合酶酸性-X（PA-X）等。由PB1、PB2和PA组成的聚合酶三聚体复合体与病毒RNA和NP蛋白形成RNA核蛋白（RNP），负责病毒RNA的转录和复制。HA、NA和M2蛋白嵌入病毒颗粒的外层包膜中，其中HA和NA易于暴露，因此是两种主要的免疫原性蛋白。在感染过程中，HA在病毒进入步骤中发挥重要作用，如附着和穿透。HA也是流感病毒表面的主要抗原糖蛋白，可以刺激宿主产生中和抗体反应。NA负责切割细胞表面存在的末端唾液酸残基，从而促进子代病毒从感染细胞中释放，并在流感病毒的传播中发挥重要作用。根据HA和NA的抗原多样性，流感病毒被分类为18个HA亚型（H1-H18）和11个NA亚型（N1-N11）。 根据世界卫生组织的估计，全球约有300万至500万人感染流感，导致大约29万至65万例因严重呼吸系统疾病相关并发症而死亡。然而，流感病毒感染通常会导致一种常见的季节性疾病，其特征是较轻的临床表现，如发热、喉咙痛、肌肉无力和一系列相对轻微的呼吸道症状（包括咳嗽和流鼻涕）。大多数患者在一周内从这些症状中恢复；然而，在某些人群亚组中，如老年人、儿童、孕妇和免疫抑制疾病患者，流感病毒感染可能非常严重，可能导致死亡。在20世纪，已经记录了4次流感病毒感染的大流行，包括1918年H1N1大流行（也称为西班牙流感）、1957-1958年H2N2大流行（亚洲流感）、1968-1969年H3N2大流行（香港流感）和2009年的另一次H1N1大流行（墨西哥或猪流感）。据估计，1918年西班牙流感在全球造成了约20亿感染和2100万死亡。在1957-1958年，H2N2亚型流感病毒的爆发起源于亚洲，然后传播到全球，造成约100万至400万人死亡。十年后，由H3N2亚型流感病毒引起的另一次流感大流行起源于香港，导致全球100万至300万人死亡。最新的2009年墨西哥或猪流感大流行是由H1N1亚型流感病毒引起的，影响了214个国家，造成约20万人死亡。除了主要包括H1N1和H3N2的人类流感病毒外，一些流感病毒还可以感染其他动物物种，包括猪流感H1N1、H3N2和H1N2，以及H5、H7和H9亚型的禽流感病毒。值得注意的是，在上述流感大流行中，有几次是由禽源性流感病毒的跨物种传播引起的，如西班牙流感H1N1、亚洲流感H2N2和香港流感H3N2病毒。 目前，有几种治疗流感病毒感染的治疗方法。三类抗流感病毒药物可以分类为病毒M2离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂（NAIs）。首批获准用于治疗流感病毒感染的抗病毒药物是金刚烷胺和金刚乙胺，这两种小分子药物来自金刚烷药物类别。这两种药物通过作为病毒M2离子通道的抑制剂，通过施加静电阻碍，阻止H+流通过M2通道进入病毒颗粒，从而抑制病毒复制。由于M2离子通道被阻断，病毒核糖核蛋白的传递被阻止。尽管金刚烷胺和金刚乙胺是最早的两种获准抗流感药物，流感病毒迅速进化为具有药物耐药表型的病毒变体，通过在M2的跨膜域的氨基酸位置27、30、31和34处获得突变。在药物治疗后2-3天，30%-50%的患者中可以观察到病毒耐药株。自从金刚烷耐药病毒出现以来，针对流感病毒神经氨酸酶的抑制剂已经被开发出来。扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦是N-乙酰神经氨酸（2,3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸）的衍生物，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NAIs。这些NAIs结合到NA的活性位点，竞争性地抑制NA与其底物N-乙酰神经氨酸的结合。由于这种抑制，NA不能再从宿主蛋白中切割N-乙酰神经氨酸，从而阻止病毒从细胞表面膜释放。正如预期的那样，在接受这些NAIs治疗的患者中，流感病毒的NA中发生了自然突变。已经描述了两种对NA抑制剂的耐药机制。第一种涉及NA酶催化位点内的突变，破坏了它与药物的直接相互作用。第二种涉及HA的突变，减少了对其受体的亲和力，从而补偿了药物对NA活性的影响。最常见的观察到的突变，如流感A病毒N1 NA亚型的H275Y和N295S（N1编号）；流感A病毒N2 NA亚型的R292K和E119V（N2编号）和流感B病毒的R152和D198N，是赋予NA抑制剂耐药性的NA突变，以减少唾液酸酶活性和/或稳定性。除了上述两种主要的抗流感治疗药物外，还发现了一些新的抗病毒抑制剂，如聚合酶抑制剂（例如法匹拉韦和利巴韦林）、HA抑制剂（例如RO5464466、阿比多尔、MBX2329和MBX2546）、NP抑制剂（例如萘普生和姜黄素）和宿主靶向剂（例如DAS18），它们也可以作为对抗流感病毒感染的额外治疗选择。 尽管有几种治疗药物可用于抗流感治疗，但接种流感病毒疫苗仍然是预防和控制流感病毒传播的最有效方法之一，可以显著降低流感病毒感染的发病率和相关医疗并发症。常用的流感疫苗包括灭活流感疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位流感疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组病毒载体流感疫苗。在这篇综述中，我们讨论了不同流感疫苗的优缺点，病毒载体流感疫苗的开发，以及其他使用流感病毒作为载体的病毒疫苗的构建，以提供开发有效和安全新型流感疫苗的重要见解。 2.不同类型的流感疫苗及其优缺点 流感疫苗是预防和控制流感病毒感染的重要措施。目前，商业化和实验性的流感疫苗主要包括灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活疫苗和重组活病毒载体疫苗。 2.1.减毒活流感疫苗（LAIV） 减毒活流感疫苗是通过流感病毒基因组中自然发生的突变产生的毒力较低的流感病毒株，或者是通过在病毒易感细胞、胚胎鸡蛋中多次传代所谓的亲本流感病毒，或其他使病毒毒力降低的过程，即不太可能在实验感染动物中引起重大疾病的病毒。选择毒力较低的流感病毒株作为候选疫苗，进一步在人类志愿者中进行测试，然后才能被FDA考虑批准作为人类流感疫苗使用。这种类型的流感疫苗株具有低毒力和致病性，但仍允许病毒在接种后相对较短的时间内感染和增殖。LAIV主要包括流感A(H1N1)、A(H3N2)亚型和流感B病毒的维多利亚系。根据迄今为止公布的数据，LAIV的鼻内接种可以诱导粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫。特别是，LAIV诱导的细胞免疫反应，如高交叉反应性CD8+ T细胞反应和IFN-g+ T细胞反应，在学龄儿童和婴儿中比成人更好。随着反向遗传技术的进步，即在实验室环境中使用称为质粒的圆形DNA片段来工程化病毒的分子方法，许多研究中使用手动删除或替换病毒的毒力基因，以减弱病毒的毒力或工程化病毒携带一个或多个所需的外源基因。使用这些现代技术，可以产生三价和四价LAIV，分别表达三种或四种流感病毒HA基因。四价LAIV已被证明对美国2-17岁儿童提供有效的保护效果。在中国，首个三价LAIV（长春百克生物科技有限公司，中国）于2020年获得市场批准。然而，考虑到LAIV仍然可以在接种者中复制，因此可能通过称为遗传逆转的过程将其基因组演变为亲本样病毒，这可能允许它在人类群体中传播，LAIV可能对公共卫生构成潜在风险。因此，需要更多的研究来调查这些LAIV的安全性，然后才能广泛使用。 2.2.灭活全病毒疫苗 在20世纪40年代，由Thomas Francis Jr., MD和Jonas Salk, MD领导的密歇根大学研究小组开发了第一种基于灭活流感A病毒的流感疫苗，并在1945年获得军用许可。他们的疫苗使用受精鸡蛋的方法至今仍用于生产大多数流感疫苗。这种方法涉及在鸡胚（或真核细胞）中培养病毒以允许病毒增殖，然后通过加热或用化学试剂（主要是甲醛）处理来灭活病毒，以减弱病毒的感染细胞和增殖能力。然后添加佐剂以增强最终疫苗配方的免疫原性。灭活全病毒疫苗配方中包含的灭活流感病毒被剥夺了毒力和传播能力，同时保留了病毒表面蛋白抗原（如HA和NA）提供的完整抗原性。因此，灭活全流感病毒疫苗具有高安全性、保持完整病毒抗原组分、高免疫原性、提供长期免疫保护以及无毒力逆转风险的优点。如前所述，反向遗传方法的进步已经彻底改变了制备灭活全流感病毒疫苗的过程，该疫苗由已知毒力基因被删除或以某种方式操纵以灭活病毒的重组流感病毒组成。除了人类使用，灭活全流感病毒疫苗也是预防家禽行业禽流感病毒（AIV）感染的重要工具。 中国预防禽流感的流感疫苗主要是灭活全病毒疫苗。2018年，中华人民共和国农业农村部批准的六种灭活禽流感疫苗产品主要针对AIV的H5和H7亚型。这六种疫苗包括重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗和灭活疫苗（H5N2株rSD57+株rFJ56, H7N9株rGD76）。这些疫苗株使用H5N2亚型流感病毒株（D7）作为病毒基因组骨架（提供六个内部病毒基因）和来自H5N1、N5N6和H7N9突变病毒株的HA和NA基因。这些重组疫苗株是通过使用反向遗传技术产生的，针对在中国家禽养殖场主要传播的几种病毒，包括携带2.3.2.1d和2.3.4.4d亚型HA基因的H5亚型病毒，以及在家禽中产生高免疫效应的H7N9病毒。同样，由哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院新批准的重组疫苗，由灭活的重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗（H5N1株Re-11+株Re-12和H7N9株H7-Re3）组成，也是通过反向遗传技术产生的。值得注意的是，这些AIV灭活疫苗不仅可以预防家禽中的AIV感染，而且对人类公共卫生也大有裨益。自2013年开始，H7N9亚型AIV造成了数百例人类病例死亡，因此被认为是中国的一个主要公共卫生威胁。然而，在2017年9月将H5/H7二价灭活流感疫苗引入家禽业以控制H7N9流感病毒感染后，家禽中H7N9病毒的流行率大幅降低，并且使用这种疫苗对鸡进行免疫接种在预防人类感染H7N9病毒方面也非常有效，事实上，在H5/H7二价疫苗广泛使用后的两年内，仅有4例人类H7N9病例报告，与2016年10月1日至2017年9月30日记录的人类H7N9病例数量相比减少了99.5%。 灭活全流感病毒疫苗可以在体内诱导体液免疫，并产生高滴度的特异性IgG抗体。然而，这种疫苗对不同基因型或亚型的病毒交叉免疫保护效果并不理想。此外，还有其他一些缺点，包括相对较低的抗体产生率、相对较低的细胞免疫应答诱导效果，以及更多免疫剂量可能给接种动物带来过大的压力。还有报道指出，灭活全人类流感病毒疫苗可能会引起儿童高热，因此不推荐12岁以下儿童使用。随着疫苗生产工艺的进步，全人类流感病毒疫苗的生产已逐渐被淘汰。相比之下，裂解病毒疫苗和亚单位疫苗的开发和应用取得了进展，这些疫苗可以提供相当和有益的免疫效果，并具有更高的安全性。 图1、五种常用流感疫苗的组成：(A) 减毒活流感疫苗，(B) 全病毒灭活疫苗，(C) 裂解病毒流感疫苗，(D) 亚单位流感疫苗，以及 (E) 病毒体流感疫苗。这五种不同的流感疫苗在活性、抗原成分和结构组织上有所差异，这些差异影响了疫苗的免疫原性和保护效力。该图是用 Biorender.com 创建的。 2.3.裂解病毒流感疫苗 裂解病毒流感疫苗是基于灭活全流感病毒疫苗制备的。选择合适的裂解剂和条件破坏病毒包膜并裂开病毒颗粒。裂解剂以及病毒的核酸和大分子量蛋白被丢弃，而活性抗原组分（HA和NA）和部分M和NP蛋白（增强免疫反应）得以保留。这种疫苗配方可以集中并增加一定体积疫苗中活性抗原蛋白的水平，这可以在最大程度上刺激抗体产生效果，同时大大减少由病毒颗粒其他组分可能引起的不必要副作用。因此，裂解流感疫苗比灭活全流感疫苗更安全。目前，中国市场上已经批准的这类疫苗包括三价灭活流感疫苗（IIV3）和四价灭活流感疫苗（IIV4）。裂解流感疫苗是IIV3的主要组成部分，而所有的IIV4都是裂解流感疫苗。先前的研究表明，对于6个月以上儿童接种裂解病毒免疫接种，具有令人满意的保护效果，2011-2012年接种数据显示，36-59个月和6-35个月儿童接种IIV3的保护效果分别为58.2%和49.6%。此外，其他研究也表明，IIV4对流感B病毒的免疫原性高于IIV3。IIV4主要包括流感A(H3N2)、A(H1N1)亚型，以及流感B病毒的维多利亚和山形株。血凝抑制（HI）阳性转化率作为衡量接种个体血清中能中和流感病毒的抗体存在的标志，HI的几何平均滴度（GMT）平均增长率，以及疫苗免疫后血清抗体保护率均达到预期，表明疫苗具有高免疫原性。 2.4.亚单位流感疫苗 传统的亚单位疫苗是基于裂解病毒疫苗制备的，其中HA和NA抗原蛋白进一步提取、纯化和浓缩。然后，添加相应的佐剂以制备最终的亚单位疫苗配方。或者，随着基因工程技术的进步，分子克隆技术已被应用于构建亚单位流感疫苗。简言之，通过限制性内切酶消化和连接过程，将流感病毒的主要抗原蛋白基因（如HA和NA）克隆到蛋白表达质粒中。将工程质粒转移到原核或真核细胞中，以产生HA或NA蛋白抗原，然后进行浓缩和纯化，添加相应的佐剂以获得最终的亚单位疫苗（严格意思上的亚单位疫苗）。常用的IIV3疫苗包括一些通过这种方法制备的疫苗。例如，Influvac®（Solvay Pharmaceuticals BV, Weesp, The Netherlands）和Agrippal®（Chiron SRL, 现为Novartis Vaccines, Viaflorentina, Italy）疫苗在健康儿童、成人和老年人中显示出良好的免疫原性、安全性和耐受性。由于孕妇极易感染流感病毒，特别为孕妇设计了三价流感亚单位疫苗Agrippal S1和Grippol Plus，这些疫苗符合药品委员会（CPMP）标准，并已显示出为孕妇提供高滴度抗体以及长达6个月的婴儿免疫保护效果。除了人类使用，也广泛研究了猪和家禽的亚单位流感疫苗。Hernandez等同事使用杆状病毒载体系统表达猪流感病毒（SIV）HA蛋白与猪IgG2a Fc结合，可以为猪提供有效的抗H1N1 SIV效果和高滴度血清抗体，并减少肺损伤。此外，Song等同事评估了重组HA1-2亚单位疫苗对禽源H7N9流感的免疫原性，并发现含佐剂的灭活疫苗候选物可以在小鼠中诱导有效的HA1-2特异性体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。值得注意的是，它们有一些缺点，包括相对较低的免疫原性、所需的疫苗剂量大和高生产成本，所有这些都需要进一步改进。 2.5.病毒体流感疫苗 病毒体是重组流感病毒包膜，由HA、NA和病毒磷脂组成。它们的颗粒结构使病毒体保持病毒膜融合和细胞结合能力，这可以增加与亚单位和裂解病毒疫苗相比的免疫原性。病毒体可以将封装的货物送入抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并随后诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答。然而，由于缺乏佐剂，病毒体在激活APCs和触发交叉呈递方面的效率不高，这限制了CTL免疫的诱导。因此，添加合适的佐剂可以克服这一缺点。Dong等同事开发了一种新型流感疫苗配方，该配方由含有Toll样受体4（TLR4）配体单磷酸脂质A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni的病毒体组成。体外研究表明，含MPLA的病毒体比未加佐剂的病毒体更能强烈激活APCs，并且用含MPLA的病毒体免疫小鼠，病毒NP附着可以促进NP特异性CTLs的启动。病毒体也被用作短肽抗原的传递系统。Soema等同事构建了含有保守的人类HLA-A2.1流感T细胞表位M158-66的病毒体。在HLA-A2转基因小鼠中评估了这些肽装载病毒体的免疫原性和保护效果。在小鼠和树突状细胞培养中研究了病毒体的传递特性。用含肽病毒体和佐剂CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1转基因C57BL/6小鼠，增加了肽特异性CTLs的数量。用含佐剂的肽装载病毒体免疫接种减少了小鼠在异源流感病毒挑战后的体重损失。 自20世纪70年代首次提出病毒体流感疫苗以来，经过20多年的发展，流感病毒体疫苗已积累了足够的临床实验数据，并由此产生了两种产品Epaxal®和Inflexal®，它们分别由瑞士伯尔尼瑞士血清和疫苗研究所在1994年和1997年生产。其中，Inflexal®是一种适用于所有年龄组的佐剂流感疫苗，它在健康和免疫功能低下的老年人、成人和儿童中均显示出良好的免疫原性。它能够诱导B细胞反应并产生病毒抗原特异性抗体。然而，一项临床研究未能证明其能够诱导针对嵌入病毒体的两个肽段（CTL靶标抗原）的CD8+ T细胞。这一缺陷表明的是病毒体技术的局限性，还是仅仅反映了目标抗原选择的非最优性，目前尚不清楚。与灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗和病毒体疫苗类似，主要诱导B细胞介导的体液免疫。未来的研究需要开发能够同时诱导细胞免疫和体液免疫的流感疫苗，如前述的减毒活流感疫苗和下文描述的活病毒载体疫苗。 活病毒载体流感疫苗利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到不同类型的病毒基因组中，使得这种重组病毒能够在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。 由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。 3.病毒载体流感疫苗 病毒载体流感疫苗是指利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到另一种病毒的基因组中，这使得这种重组病毒能在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。 由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。 图2、复制缺陷型腺病毒载体流感疫苗的工作原理。携带流感病毒HA基因的复制缺陷型腺病毒载体能够诱导产生高滴度的血凝抑制(HI)抗体。该图是用 Biorender.com 创建的。 3.1.腺病毒载体流感疫苗 腺病毒载体疫苗使用腺病毒作为载体，通过将其与腺病毒基因组结合，表达感兴趣的病原体的保护性抗原蛋白的转基因。腺病毒载体疫苗具有几个优点，包括高水平的抗原蛋白转基因表达，以及同时诱导体液和细胞免疫应答的能力。它们也是安全的，易于制备，不需要佐剂。目前，它们被广泛开发作为预防性疫苗。 腺病毒载体疫苗策略已被用于尝试开发通用流感疫苗。由于流感病毒包括许多基因型（或亚型），并且可以通过自然遗传突变和/或基因组重排（称为抗原漂移和抗原移位）相对快速地进化，因此同时为个体提供针对不同流感病毒的保护的疫苗生产面临真正的挑战。开发通用流感疫苗是解决这一重要问题的重要方法。为此，已构建腺病毒载体流感疫苗以表达流感病毒蛋白的保守抗原区域，如HA2的茎区、嵌合HA、M2e、NP及其T/B细胞表位，因为这些主要蛋白抗原对各种亚型的流感病毒显示出高度的免疫原性和免疫保护效果。例如，Tutykhina等同事构建了一种携带流感病毒保守M2和NP抗原表位的重组腺病毒载体（Ad5-tet-M2NP），该载体能够诱导高水平的CD8+和CD4+ T细胞产生，表明接种这种重组病毒载体疫苗可以诱导针对流感病毒的强效T细胞介导的免疫应答。接种这种活腺病毒载体疫苗的小鼠在8个月后能够产生高水平的效应记忆CD44+CD62- T细胞，并对五种流感病毒（H9N2、H1N1、H5N2、H2N3和H3N2）显示出有效的长期保护效果。Hassan等同事构建了一种不同的活腺病毒载体疫苗，包含H5N1流感病毒的保守抗原表位，包括由M2外域（M2e）、血凝素（HA）融合域（HFD）、核蛋白的T细胞表位（TNP）和HA a-螺旋域（HaD）组成的多表位（ME）。这种腺病毒载体ME疫苗诱导了体液和细胞免疫应答，减少了接种小鼠肺部的流感病毒滴度，并显示出相对良好的免疫保护效果，能够抵抗H5、H7和H9流感病毒的挑战。然而，用Ad-ME载体疫苗免疫的小鼠在挑战后的肺部流感病毒滴度仍然显著高于匹配的HA对照疫苗接种动物，这表明最佳的抗体介导保护可能需要结构完整的HA免疫原。因此，还可以基于所谓的计算优化广谱反应原（COBRA）概念，计算设计表达结构完整、全长HA作为免疫原的其他类型的基于Ad的疫苗。 目前，5型腺病毒（Ad5）是最常用的人腺病毒（AdV）载体。Wu等同事构建了一种复制缺陷的重组AdV（rAd5-avH1HA），在单轮细胞感染后能够表达H1N1流感病毒（A/swine/Zhejiang/199/2013株）的HA蛋白。作者表明，这种疫苗能够诱导产生高滴度的中和抗体，并显著减少接种的BALB/c小鼠鼻腔和肺部的挑战流感病毒的复制。由于大多数人对Ad5具有自然免疫力，非人源重组腺病毒载体，如牛腺病毒（BAdV），也越来越多地受到研究人员的关注。例如，Ekramy等同事使用BAdV-3构建了一种重组腺病毒载体流感疫苗BAd-H5HA，表达H5N1亚型禽流感病毒的HA基因，并在小鼠中比较了与HAdV类型C5（HAdV-C5）载体H5N1疫苗（HAd-H5HA）的免疫效果。他们首次发现，低剂量（1×106 PFU）肌肉注射BAd-H5HA可以在小鼠中诱导强烈的体液和细胞免疫应答，并提供针对异源H5N1病毒的有效免疫保护。相比之下，HAd-H5HA需要较高剂量（1×108 PFU）才能达到相当的免疫效果。 3.2.沙粒病毒载体流感疫苗 沙粒病毒是一类具有双节段RNA基因组的包膜RNA病毒。沙粒病毒包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、拉沙病毒（LASV）、胡宁病毒（JUNV）、马丘波病毒（MACV）、皮钦德病毒（PICV）等。这些沙粒病毒（也称为哺乳动物沙粒病毒）可以通过感染啮齿动物的粪便、尿液、血液或唾液传播给人类，它们是沙粒病毒的自然宿主。由LASV、JUNV和MACV等致病性人类病毒引起的严重出血热是主要的感染相关症状。相反，许多其他沙粒病毒，如PICV，在感染后不引起人类和哺乳动物的任何临床表现，因此被认为是非致病性的（即无害的）偶然宿主。同样，LCMV通常不会对普通人群构成严重健康威胁，因为大多数LCMV感染的病例都是无症状或轻微的。 先前的研究表明，沙粒病毒在感染的早期主要感染重要的免疫细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，这使它们成为疫苗开发的理想病毒载体，因为它们靶向这些能够自然增强对抗原蛋白免疫应答的抗原呈递细胞（APCs）。已有几项研究利用反向遗传技术生成携带感兴趣抗原蛋白的重组LCMV。Emonet等同事开发了一种三质粒反向遗传系统来生成三节段LCMV。通过该系统恢复的重组LCMV能够同时携带多达两个感兴趣的抗原蛋白的转基因。2018年6月，专注于肿瘤学和传染病创新活性免疫疗法的临床阶段生物技术公司Hookipa Biotech AG（“Hookipa”）和研究型生物制药公司Gilead Sciences, Inc.（“Gilead”）宣布了一项研究合作和许可协议，授予Gilead对Hookipa的TheraT®和Vaxwave®沙粒病毒载体技术的独家权利，用于乙型肝炎病毒（HBV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）两种主要慢性传染病的指示。值得注意的是，基于LCMV载体并表达人类乳头瘤病毒16型（HPV16）E7和E6开放阅读框（ORFs）的非致癌性融合蛋白作为模型肿瘤相关抗原的TheraT®载体，以及基于PICV的类似病毒结构，目前正在作为HPV16阳性头颈癌的重复原始增强免疫策略进入临床1期测试。这是首次在人类（FIH）第1期（剂量递增）/第2期（剂量扩展）多国、多中心、开放标签研究中包括140名HPV16+确诊癌症参与者。虽然这在使用LCMV等沙粒病毒载体作为治疗性肿瘤疫苗方面迈出了重要一步，但值得注意的是，约5%的人类人群显示出先前接触LCMV的证据，因此存在预先存在的（LCMV）载体免疫问题。此外，尽管大多数获得性LCMV感染是无症状或轻微的，但先天性LCMV感染可能非常严重，可能导致自然流产和胎儿死亡，或引起脑功能障碍。最近的报告还表明，LCMV感染免疫受损个体也可能导致一些严重的医疗并发症。在极少数情况下，LCMV感染可能导致某些形式的神经系统疾病，如无菌性脑炎、脑炎、脑膜炎或甚至在健康个体中引起小头畸形，因此必须谨慎使用。 PICV与LCMV具有相似的病毒基因组结构，但与全球发现的LCMV不同，其宿主是普通家鼠属Mus musculus。PICV仅在南美洲哥伦比亚的皮钦德谷特有的稻大鼠属oryzomys albigularis中发现。与LCMV不同的是，PICV在人类中不会引起疾病。Dhanwani等同事构建了一个PICV的三质粒反向遗传系统，并用它来开发PICV载体流感疫苗。当将A型流感病毒（HA和/或NP）的抗原蛋白转基因插入重组PICV载体疫苗（rP18tri）时，这些PICV载体流感疫苗可以有效地在接种的小鼠中诱导针对HA和NP的特异性体液和适应性免疫应答，并能提供持久的、有效的保护效果，使接种的动物能够抵御致命的小鼠适应株流感病毒（PR8）。此外，对PICV的中和抗体（nAb）反应水平非常低。这种免疫逃避现象部分可以用Pichinde病毒粒子表面膜上的糖蛋白（GPC）高度糖基化来解释，这使得病毒无法被nAbs识别。因此，PICV载体疫苗比LCMV载体疫苗具有一个主要优势，即PICV基疫苗可以克服初次加强免疫期间抗载体免疫的问题。尽管仍处于开发的早期阶段，但PICV载体已被证明相对安全，可以避免由于PICV仅在哥伦比亚自然发现而预先存在的免疫力，并且已显示出作为开发新型流感和其他病原体疫苗的病毒载体的巨大潜力。 最近的一项研究表明，基于PICV和LCMV的病毒载体可以被设计来传递肿瘤相关抗原，如HPV16 E6和E7基因的非致癌性融合蛋白，在异源原始增强方案中可以有效诱导肿瘤特异性CTL（CD8+ T细胞）反应，消除已建立的实体肿瘤并保护接种的小鼠免受肿瘤再挑战。沙粒病毒家族成员可以诱导强烈的CTL反应和低水平的中和抗体，这有助于克服其他病毒载体中常见的抗载体免疫问题，例如痘病毒和腺病毒载体。基于这些激动人心的新发现，已经建立了一种新的基于沙粒病毒的免疫治疗策略。 图3、不同类型病毒载体及其疫苗的优势、劣势以及应用。该图是用 Biorender（Biorender.com）创建的。 3.3.新城疫病毒载体流感疫苗 新城疫病毒（NDV）是一种单股负链RNA病毒，属于副黏液病毒科，其基因组从3'端至5'端依次编码六个结构蛋白（NP、P、M、F、HN和L）。NDV基因组能够被改造以稳定表达大片段的感兴趣转基因（4.5 kb或更大），并且能够表达超过3种不同的非NDV蛋白。理论上，任何插入NDV两个蛋白编码序列之间的外源基因都可以被表达。先前研究表明，当外源基因插入NDV P和M基因之间时，表达水平最高。 NDV能够感染不同哺乳动物的呼吸道上皮细胞，如家禽、人类、猪、小鼠和非人灵长类动物（NHPs）。NDV能够激活宿主的局部粘膜免疫，诱导产生高效的体液和细胞免疫应答。此外，NDV的整个复制周期都在细胞质中进行，从而最小化了病毒基因组与宿主基因组之间重组的风险。NDV载体疫苗的应用可以通过喷雾和/或将疫苗加入饮水等大规模免疫方法进行。另一个优点是NDV在鸡胚中高效增殖，有利于重组NDV载体疫苗的大规模生产。因此，NDV载体已成为人类和动物疫苗开发的重要对象。 人类不是NDV的自然宿主，因此NDV对人类不太致病。此外，已经证明NDV与已知的多种人类副黏液病毒（如呼吸道合胞病毒RSV和人类副流感病毒hPIV）的氨基酸同源性和相似性较低，因此人类对这些其他呼吸道病毒的免疫对NDV的影响有限。Bukreyev等同事构建了一种表达人类副流感病毒3型（HPIV3）HN蛋白的重组NDV，随后将其作为活病毒载体疫苗（106.5 PFU）用于非洲绿猴和恒河猴的鼻内和气管内接种。活重组NDV载体HPIV3疫苗仅在接种动物的呼吸道复制。28天后进行第二次免疫。结果显示，接受活重组NDV载体HPIV3疫苗免疫的动物的中和抗体血清滴度显著高于接受野生型HPIV3免疫的动物。为了评估NDV载体疫苗对人类流感病毒的有效性，Nakaya等同事使用NDV Hitchner B1株作为病毒载体，将人类流感A/WSN/33病毒的HA基因插入NDV P和M基因之间，构建了rNDV/B1-HA疫苗。结果表明，重组NDV载体流感疫苗能够在接种的小鼠中诱导产生强大的体液免疫应答，通过高水平的针对流感病毒HA蛋白的抗体滴度提供对A/WSN/33病毒的保护效果。DiNapoli等同事研究了NDV载体疫苗对非洲绿猴高致病性禽流感病毒（HPAIV）的免疫效果，他们用活重组NDV载体疫苗（10 PFU）表达H5N1 HPAIV HA蛋白（NDV-HA）对动物进行免疫。两次疫苗接种后，诱导产生了高滴度的中和抗体，并在呼吸道诱导产生了高水平的粘膜免疫球蛋白IgA反应。这些发现表明，NDV载体流感疫苗可能对人类使用具有潜力。 新城疫和禽流感都是严重威胁家禽业的重要传染病。因此，通过疫苗接种预防这两种疾病具有特别的意义。构建高效的新城疫和禽流感二价疫苗可以减少疫苗生产成本和通过多种疫苗给动物带来的不利压力。NDV载体AIV疫苗是解决这一问题的策略之一。Ma等同事构建了一种表达A/chicken/Iowa/04-20/2015 (H5N2)病毒HA蛋白的重组NDV病毒，用作流感疫苗候选物。作者发现，无论是活NDV载体流感疫苗还是灭活NDV载体流感疫苗都能在接种后两周诱导产生针对H5N2 HA蛋白和NDVLaSota株的中和抗体。然而，活NDV载体流感疫苗的免疫原性低于灭活NDV载体流感疫苗。此外，这些疫苗对高致病性H5N2 A/turkey/Minnesota/9845-4/2015病毒的复制显示出效果，这通过接种动物的有限病毒脱落证明。免疫鸡的血清还能在病毒挑战后中和高致病性H5N1和H5N8病毒。在另一项研究中，Xu等同事将H9亚型AIV HA蛋白的外域与NDV F蛋白的跨膜域和细胞质尾区融合，构建了重组NDV载体流感rmNA-H9F疫苗候选物。接种后，这种疫苗能够保护鸡免受致死剂量的NDV和AIV H9N2的挑战，并诱导产生高水平的NDV-HI、H9-HI和分泌型IgA。 尽管NDV载体AIV疫苗已经在实验室实验中显示出显著的积极免疫效果，但存在针对NDV的母源抗体可能会减少NDV载体疫苗的有益免疫效果。为了解决这个问题，一些研究小组建议使用嵌合NDV载体。通过用具有不同血清学特性的禽副黏液病毒2型（APMV-2）的对应物替换NDV F和HN蛋白的外域构建了嵌合NDV载体（NDV株BeaudetteC）。这绕过了针对NDV的预先存在的母源抗体，并为HPAI病毒提供了有效的保护。Chowdhury等同事也使用这种方法构建了表达H7 HA蛋白保守序列的重组嵌合NDV载体。他们的发现显示，由于母源抗体的影响，4周龄鸡在异源初次加强免疫策略后没有诱导出高滴度的NDV LaSota特异性抗体。然而，通过NDV/HA异源初次免疫后，H7中和抗体的滴度已经超过了16 HI，这可以保护肉鸡和火鸡免受H7N8 HAPI的侵害，同时也减少了病毒脱落。 3.4.杆状病毒载体流感疫苗 杆状病毒是一种感染昆虫细胞的病毒，因此，只有无脊椎动物能被这种病毒感染。Autographa californica多重囊核多角体病毒（AcMNPV）是研究实验室中最常用的杆状病毒。AcMNPV是一种大型双链DNA病毒，基因组为133.9 kb，包含156个开放阅读框（ORFs）。AcMVPV的基因组较大，因此有足够的位置插入感兴趣的外源基因以在病毒感染的细胞中表达。在过去的三十年中，为了这个目的，杆状病毒表达载体系统（BEVS）不断优化。在过去的十年中，基于BEVS的疫苗研究逐渐增加，有7种商业化产品已获批准用于人类，其中包括人类乳头瘤病毒疫苗、流感疫苗、前列腺癌疫苗和脂蛋白脂酶缺陷疫苗。 随着BEVS的不断进步，这些技术也被应用于构建杆状病毒载体流感疫苗。Influenza-Flublok Quadrivalent，一种四价重组杆状病毒载体流感疫苗，配方每0.5 mL剂量含有180 mg，每种流感病毒株的HA含量为45 mg：A/Hawaii/70/2019(H1N1)、A/Minnesota/41/2019（类似A/Hong Kong/45/2019的病毒）(H3N2)、B/Washington/02/2019和B/Phuket/3073/2013，可用于2020-2021年流感季节的人类疫苗接种。Flublok Quadrivalent是一种用于主动免疫以预防由甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的疾病的疫苗。它已于2017年获批用于18岁及以上人群。Influenza-Flublok的三价版本于2013年获得许可，但后来被四价版本取代。与灭活流感疫苗相比，Flublok配方中相对较高的流感抗原水平可以增强疫苗的免疫原性并减少局部反应原性。此外，Liu等同事评估了另一种基于BEVS的H5亚单位疫苗（A/goose/Guangdong/1/96），发现这种疫苗可以保护BALB/c小鼠以及无特定病原体（SPF）和商业肉鸡，因此可以作为人类和动物候选H5流感疫苗株。此外，Yu等同事使用BEVS构建了一种重组杆状病毒载体BmNPV-CMV/THB-P10/CTLT疫苗，该疫苗包含H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的T淋巴细胞表位（CTLT）的融合密码子优化序列，以及H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的Th和B细胞表位（THB）的融合密码子优化序列，然后用于小鼠和鸡的免疫。他们的发现表明，疫苗可以在两种动物中激活流感病毒特异性的体液和细胞反应，表明疫苗可以作为针对不同亚型AIV的通用疫苗。尽管BEVS具有作为疫苗开发有吸引力的载体平台的独特特性，但考虑到与BEVS相关的因素，如蛋白质复杂性、翻译后修饰、规模和成本，它并不适用于所有疫苗产品开发。应用杆状病毒载体疫苗作为常用疫苗载体平台的主要限制是缺乏人类免疫的安全指南。需要进一步研究以成功将技术整合到现实生活情况中。还需要在哺乳动物系统中建立完整的杆状病毒基因表达，以进一步增强基于杆状病毒的疫苗的安全性。杆状病毒可能是具有作为潜在疫苗的一些有吸引力属性的下一代流感疫苗。 3.5.疱疹病毒载体流感疫苗 疱疹病毒是一种具有大型双链DNA基因组的病毒，大小范围约为125到240 kbp。这些疱疹病毒在宿主范围上受到限制，例如，禽类疱疹病毒只能感染禽类。有几种疱疹病毒载体可用，包括火鸡疱疹病毒（HVT）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）和鸡马立克氏病病毒（MDV）。MDV疫苗已经在养禽业中使用了40多年，因为它可以诱导对抗马立克氏病的终身免疫。HVT已被用作病毒载体来表达各种抗原蛋白，如AIV的HA蛋白和NDV的F蛋白。已有几种基于HVT载体的商业疫苗表达H5亚型AIV的HA蛋白，如Vectormune® AI [CEVA Animal Health, Lenexa, KS, USA (www.vectormune-ai.com)]。这种疫苗为火鸡和家鸭提供了针对H5亚型HPAI的有效免疫保护。Kapczynski等同事构建了一种表达2.2 H5N1 AIV HA蛋白的重组HVT载体AIV疫苗，该疫苗在鸡接种后对H5N1和H5N2 HPAIV挑战产生了显著的保护效果，使动物的存活率达到80%-95%。此外，接种HVT载体AI疫苗的鸡的脾T淋巴细胞能够识别MHC匹配的目标细胞感染H5、H6、H7或H9 AI病毒。Li等同事使用细菌人工染色体（BAC）克隆技术构建了另一种表达H7N1 HPAIV HA基因（rHVT-H7HA）的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H7HA可以诱导产生H7特异性免疫反应，帮助鸡抵御高致病性H7N1病毒的感染，并显著减少病毒脱落。Liu等同事还使用BAC克隆技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了一种表达H9 HA蛋白的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H9可以在接种后35天诱导鸡产生体液和细胞免疫反应，这通过针对H9的高滴度中和抗体HI和激活IFN-g+ CD4+和IFN-g+ CD8+ T细胞证明。当接种的动物在接种后35天受到H9N2 AIV挑战时，在鸡的气管和肛门拭子中在挑战后3天和5天没有观察到病毒脱落。此外，在接种鸡的器官（气管、肺、脾和肾）中没有检测到H9N2病毒。这些发现表明，HVT作为禽流感疫苗开发的病毒载体具有前景。然而，疱疹病毒载体的一些缺点，如高水平的预先存在的抗载体免疫、通过卵内途径提供完全保护所需的相对较长时间以及宿主细胞终身感染可能造成的风险，可能会阻碍这种病毒载体在疫苗开发中的考虑。 流感疫苗的开发包括季节性流感疫苗和通用流感疫苗两个主要方向。季节性流感疫苗针对每年流行的流感病毒株进行设计，而通用流感疫苗则旨在提供针对多种流感病毒株的广泛保护。 4.季节性流感疫苗和通用流感疫苗的开发 许多前述的病毒载体疫苗已被证明是安全且具有免疫原性的，它们能够激活针对感兴趣抗原蛋白的体液和细胞免疫反应，无论是在局部粘膜部位还是系统性地。因此，病毒载体疫苗可以克服传统灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗的一些固有缺点。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需要进一步研究。流感疫苗开发中真正的挑战是如何应对流感病毒频繁的抗原漂移和抗原转变，以及流感病毒的快速突变率。为了克服这个问题，最近的努力集中在改进流感病毒的流行预测，以开发能够与预测的季节性病毒紧密匹配的疫苗候选物，以及开发能够对多种流感病毒株提供广泛保护效果的通用流感疫苗。 4.1.季节性流感疫苗的开发 流感监测是一项全球性的公共卫生活动，每年在全球范围内进行。世界卫生组织（WHO）自1952年起组织了这一协调的全球性努力，以追踪流感病毒感染，最初称为全球流感监测网络（GISN），2011年更名为全球流感监测与响应系统（GISRS），并扩展到包括113个成员国的143个机构。根据这一流感病毒监测系统的主要两种方法，通过综合征监测系统从门诊或医院收集信息，以监测当地社区流感疾病的新出现，而循环流感病毒株的病毒学特征则由实验室监测系统收集。每年两次，全球季节性流感病毒循环的所有收集到的信息都会被GISRS整合、分析，并提供给适当的当局，用于季节性流感疫苗株的选择和通用流感疫苗的开发。自20世纪50年代以来的几十年里，流感病毒疫苗株的选择依赖于年度血清学检测的数据，这些数据提供了免疫系统对当前循环流感病毒的反应的表型测量。然而，血清学检测有一定的缺点，包括劳动强度大、实验室间数据不一致，以及数据不公开和/或难以解释或扩大规模。因此，这些方法只能应用于分析一小部分流感病毒。因此，迫切需要开发基于监测数据的流感病毒持续进化分析工具，并为选择具有更广泛保护潜力的流感疫苗株提供建议。系统发育树或进化树是用于可视化循环流感病毒遗传进化的工具之一。多年来，研究人员开发了多个类似的工具来生成系统发育树并分析循环流感病毒的遗传进化。其中一种方法称为Nextflu（https://bedford.io/projects/nextflu/），这是一个由Neher和Bedford设计的在线可视化工具。Nextflu可以实时跟踪循环流感病毒的进化，特别是人类季节性流感病毒的进化。用户可以通过可视化循环流感病毒株的遗传和流行病学特征来分析季节性流感循环模式，这可以为即将到来的流感季节提供预测。同样，人群水平流感病毒序列的AD图结合了系统发育推断和祖先特征状态重建的信息，这是一种依赖于使用最大简约法将生物体的特征状态映射到系统发育树上的方法，以识别可能处于定向选择下的等位基因和相关遗传变化。除了系统发育树，抗原图或抗原图也是重要的分析工具。抗原图已经使用A型（H3N2）人类流感病毒的数据开发，并常规用于分析WHO流感监测网络的全球数据，作为流感疫苗株选择过程的一部分。抗原图基于反映病原体抗原特性的血清学数据。流感病毒的抗原特性通常基于对病毒分离物进行的血凝抑制（HI）数据，这些数据针对特定株的感染后雪貂抗血清进行测试。通过使用上述工具可视化流感病毒的自然进化，研究人员可以构建统计学习模型来解释抗原差异并预测流感病毒的下一步进化。例如，Steinbrück及其同事结合AD图和抗原树分析了2002年至2007年收集的流感A型（H3N2）的HA基因的进化，并成功预测了H3N2病毒在回顾性测试场景中的抗原进化。 尽管能够预测下一个季节性流感病毒株，但通常需要大约一年的时间来完成流感疫苗株的选择，并通过疫苗生产、发布和分发过程。然而，在这段时间里，循环的流感病毒可能会进一步变异，使其与选定的疫苗株不相似，正如最近的例子所示，预测的H3N2病毒流感疫苗，这种病毒与其他季节性流感病毒相比，进化得特别快且不可预测，并在2004年至2019年过去十五个流感季节中的六个季节中，使季节性流感疫苗与自然循环的H3N2株不匹配。此外，季节性流感疫苗刺激的抗体水平可能只能在相对较短的时间内维持，然后在流感季节结束前降至亚保护水平。这些问题可能会使预测和生产最佳季节性流感疫苗的能力复杂化，因此可能需要其他方法（例如，通用流感疫苗的开发）来生产覆盖不同流感病毒株的更广泛流感疫苗。 4.2.通用流感疫苗的开发 通用流感疫苗旨在提供针对甲型和乙型流感病毒的保护，而不受它们已知的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）或其他病毒基因或基因片段的抗原漂移和移位的影响。目前，通用流感疫苗开发的几种常见靶点包括HA蛋白的保守茎部结构域、M2离子通道（M2e）的外域以及内部蛋白核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）。 由于流感病毒的茎部区域位于病毒粒子表面的一个不易被中和抗体接近的区域，因此它受到宿主免疫系统的选择压力较小，因此在不同流感病毒之间高度保守。因此，针对HA蛋白的这个保守茎部区域，可以合理地假设能够诱导出针对流感病毒内部亚型、不同亚型之间以及不同群组之间的广泛反应性抗体。 已经探索了包括生成具有HA头部高度糖基化、"无头"HA、仅表达茎部的长α螺旋（LAH）结构域以及开发嵌合和马赛克HA以诱导针对茎部的抗体等不同策略的候选通用流感疫苗。通过这些策略开发的一些通用流感疫苗已进入人体临床试验，并显示出一些令人鼓舞的结果。例如，一项包括65名参与者的I期临床试验结果表明，他们接受了两次不同组合的嵌合HA活流感病毒、灭活流感病毒或灭活流感病毒加佐剂的免疫接种，显示出诱导抗茎部H1抗体的证据。更令人鼓舞的是，结果显示，在接受了两次嵌合HA灭活和佐剂流感病毒疫苗的参与者中，诱导的抗茎部抗体在1.5年内比基线高出4倍以上。 其他尝试生产通用流感疫苗的方法涉及以流感病毒M2e蛋白为靶点。虽然由流感病毒M2e蛋白诱导的特异性中和抗体可以通过补体或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性与感染病毒的宿主细胞上的M2e结合，但一些研究表明，接种个体中M2e特异性血清抗体滴度迅速下降。这种弱抗原免疫原性的例子，再加上大多数诱导的抗体是非中和抗体，突出了通用流感疫苗开发过程中的一些挑战。因此，建议通过研究更保守的流感病毒抗原（或某些病毒抗原的保守区域）与使用适当的佐剂和其他增强抗原免疫原性的方法相结合，以及/或研究将通用流感疫苗与其他已知疫苗联合使用，这些方法可能有助于增强产生针对不同流感病毒株的更持久和广泛保护性的HA/NA中和抗体的潜力。 通用流感疫苗的开发是一个复杂的过程，需要综合考虑病毒的保守抗原、疫苗设计策略、佐剂的选择以及免疫程序的优化等多个方面。随着对流感病毒以及宿主免疫应答机制的深入了解，未来有望开发出能够提供广泛保护的通用流感疫苗。 5.重组流感病毒作为疫苗载体的开发 反向遗传系统可用于实验室中生成重组流感病毒，这是将其作为疫苗载体的基础。流感病毒(IAV)感染可以诱导CD4+和CD8+ T细胞产生细胞因子，这些细胞因子进而促使CD4+ T细胞分化为Th1或Th2细胞。Th1细胞参与CD8+细胞毒性T细胞介导的免疫应答，识别并破坏病毒感染细胞，抑制病毒复制和增殖。另一方面，Th2细胞可以激活B细胞，促进中和抗体的产生，从而参与宿主的体液免疫。减毒活流感疫苗(LAIV)在感染早期也能诱导粘膜免疫。 近年来，重组流感病毒已被用作病毒载体。将外源基因以不同的克隆策略插入流感病毒基因组，可能会产生不同的免疫应答。例如，一些研究表明，当外源基因插入流感病毒HA或NA的基因片段时，重组流感病毒载体疫苗能够介导针对外来蛋白的强烈中和抗体应答。相反，将外源基因插入流感病毒内部蛋白（例如NP和M1）或编码核糖核蛋白（例如PB2、PB1和PA）的基因片段，可以诱导针对外来蛋白的CD8+ T细胞应答。 图4、研发针对流感病毒血凝素（HA）茎部的通用流感疫苗的策略：超糖基化HA、无头HA、长α螺旋（LAF）片段、嵌合HA和马赛克HA。该图是用 Biorender.com 创建的。 基于这些发现，Isakova-Sivak等同事构建了两种重组活流感病毒载体腺病毒疫苗(LAIV-AdV)，通过将AdV的T细胞表位插入授权的冷适应H7N9 LAIV病毒的全长NA基因和截短的NS1基因的ORF中。使用这种LAIV-AdV疫苗免疫，可在C57BL/6J小鼠中诱导相对较强的流感病毒特异性抗体和细胞介导的免疫，足以保护接种动物免受致病性H7N9流感病毒和人AdV5感染。此外，Matyushenko等同事构建了两种重组LAIV载体疫苗，通过将编码RSV M2蛋白T细胞表位的基因插入H7N9亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)或非结构蛋白(NS1)中。这两种重组LAIV载体疫苗都能同时保护小鼠免受流感病毒和RSV感染，并在接种和挑战动物的肺部及肺组织驻留记忆T细胞(TRM)亚群中激活流感和RSV特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。 尽管取得了这些积极的结果，重组流感病毒载体疫苗的安全性和有效性仍需进一步研究和改进。作为减毒活流感病毒，当用作病毒载体时，它仍能复制，因此存在与流通的野生型流感病毒发生基因重组和重配的可能性。此外，当病毒载体疫苗在实验室或接种个体中连续传代时，可能会丢失外源基因。 6.结语 许多病毒载体流感疫苗已被证明是安全和具有免疫原性的，能够激活针对局部粘膜位点或系统性抗原蛋白的体液和细胞免疫应答。这些病毒载体流感疫苗因此可以克服传统流感亚单位疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗的一些固有缺点。到目前为止，已经研究了许多病毒载体流感疫苗，其中一些显示出可接受的有效性水平。这些新型病毒平台和技术为人类、家畜以及伴侣和外来动物的许多疾病提供了快速、高效和成本效益的疫苗生产方式。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需进一步研究。流感疫苗开发中的一个真正挑战是如何应对频繁的抗原漂移和移位，以及这些病毒的快速变异率。解决这一棘手但重要问题的潜在解决方案是通过优化预测下一种主要流感病毒株的方法，以便开发出具有最大保护价值的更好的季节性疫苗，和/或通过开发仍在深入研究和开发阶段的通用流感疫苗。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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