Nexiguran ziclumeran

Enrollment in the global Phase 3 MAGNITUDE trial of nexiguran ziclumeran (nex-z) in ATTR with cardiomyopathy (ATTR-CM) continues to track ahead of projections; Tracking to enroll at least 650 patients cumulatively by year-end Expanding total enrollment of the MAGNITUDE study to approximately 1,200 patients, subject to health authority review, with no expected impact on previous projected enrollment or financial runway Expect to complete enrollment by first half 2026 in the global Phase 3 MAGNITUDE-2 study evaluating nex-z in hereditary ATTR amyloidosis with polyneuropathy (ATTRv-PN) Expect to complete randomization in the global Phase 3 HAELO study of lonvoguran ziclumeran (lonvo-z) in hereditary angioedema (HAE) during the third quarter Additional data from the Phase 1/2 study evaluating lonvo-z in HAE and longer-term data from the Phase 1 study evaluating nex-z in ATTR-CM and ATTRv-PN expected in the second half of 2025 Ended the second quarter with approximately $630.5 million in cash, cash equivalents and marketable securities; Expected to fund operations into the first half of 2027 and into the anticipated first commercial launch CAMBRIDGE, Mass. , Aug. 07, 2025 (GLOBE NEWSWIRE) -- Intellia Therapeutics, Inc. (NASDAQ:NTLA), a leading clinical-stage gene editing company focused on revolutionizing medicine with CRISPR-based therapies, today reported operational highlights and financial results for the second quarter ended June 30, 2025 . “We are exceeding many of our internal expectations,” said Intellia President and Chief Executive Officer John Leonard , M.D. “The enthusiasm from both patients and physicians for Intellia’s late-stage programs has resulted in strong enrollment numbers that allow us to plan to enhance the Phase 3 MAGNITUDE trial in ATTR-CM and accelerate completion of the Phase 3 HAELO study in HAE ahead of our original plans. We are full steam ahead in achieving our mission of getting one-time therapies to more patients.” Second Quarter 2025 and Recent Operational Highlights Hereditary Angioedema (HAE) Lonvoguran ziclumeran (lonvo-z, also known as NTLA-2002): Lonvo-z is a wholly owned, investigational in vivo CRISPR-based therapy designed to knock out the KLKB1 gene in the liver, with the goal of lifelong control of HAE attacks after a single dose. Recruitment ended earlier than expected during the second quarter and the Company now expects to complete randomization in the global Phase 3 HAELO study during the third quarter 2025. Intellia presented three-year follow-up data from the Phase 1 portion of the ongoing Phase 1/2 study after receiving a single dose of lonvo-z. Results were shared in an oral presentation at the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Congress 2025 on June 15 in Glasgow, United Kingdom . In the Phase 1 portion of the study, a one-time dose of 25 mg (N=3), 50 mg (N=4) or 75 mg (N=3) of lonvo-z was administered via intravenous infusion and plasma kallikrein protein levels were measured along with HAE attacks. At the time of the February 12, 2025 data cutoff, all 10 patients were attack-free and treatment-free for a median of nearly two years. With up to three years of follow-up, a single dose of lonvo-z led to a mean reduction in monthly HAE attack rate of 98% over the study period, compared to pre-treatment baseline. For all 10 patients, deep, dose-dependent and durable reductions in plasma kallikrein protein continued to be observed through the latest assessment. Across all three dose levels, lonvo-z was generally well tolerated and showed a safety profile consistent with earlier data presented at EAACI in 2024. The most frequent adverse events during the study period were infusion-related reactions (IRRs). IRRs were mostly Grade 1 and resolved with all patients receiving the full dose. With up to three years of follow-up, no treatment-emergent serious adverse events were observed, and no treatment-related adverse events were observed during the period following 28 days after dosing. Intellia expects to present additional data from the ongoing Phase 1/2 study in the second half of 2025. The Company is on track to submit a Biologics License Application (BLA) in the second half of 2026. Recruitment ended earlier than expected during the second quarter and the Company now expects to complete randomization in the global Phase 3 HAELO study during the third quarter 2025. Intellia presented three-year follow-up data from the Phase 1 portion of the ongoing Phase 1/2 study after receiving a single dose of lonvo-z. Results were shared in an oral presentation at the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Congress 2025 on June 15 in Glasgow, United Kingdom . In the Phase 1 portion of the study, a one-time dose of 25 mg (N=3), 50 mg (N=4) or 75 mg (N=3) of lonvo-z was administered via intravenous infusion and plasma kallikrein protein levels were measured along with HAE attacks. At the time of the February 12, 2025 data cutoff, all 10 patients were attack-free and treatment-free for a median of nearly two years. With up to three years of follow-up, a single dose of lonvo-z led to a mean reduction in monthly HAE attack rate of 98% over the study period, compared to pre-treatment baseline. For all 10 patients, deep, dose-dependent and durable reductions in plasma kallikrein protein continued to be observed through the latest assessment. Across all three dose levels, lonvo-z was generally well tolerated and showed a safety profile consistent with earlier data presented at EAACI in 2024. The most frequent adverse events during the study period were infusion-related reactions (IRRs). IRRs were mostly Grade 1 and resolved with all patients receiving the full dose. With up to three years of follow-up, no treatment-emergent serious adverse events were observed, and no treatment-related adverse events were observed during the period following 28 days after dosing. Intellia expects to present additional data from the ongoing Phase 1/2 study in the second half of 2025. The Company is on track to submit a Biologics License Application (BLA) in the second half of 2026. Transthyretin (ATTR) Amyloidosis Nexiguran ziclumeran (nex-z, also known as NTLA-2001): Nex-z is an investigational in vivo CRISPR-based therapy designed to inactivate the TTR gene in liver cells, thereby preventing the production of transthyretin (TTR) protein for the treatment of ATTR amyloidosis. Nex-z offers the possibility of halting and reversing the disease by driving a deep, consistent and potentially lifelong reduction in TTR protein after a single dose. Intellia leads development and commercialization of nex-z in collaboration with Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ATTR Amyloidosis with Cardiomyopathy (ATTR-CM): Enrollment in the global Phase 3 MAGNITUDE trial is progressing ahead of the Company’s projections and the Company is tracking to enroll at least 650 patients cumulatively by year-end. Intellia is amending the MAGNITUDE study to expand enrollment to approximately 1,200 patients from 765 patients, subject to health authority review. Expanding the patient number in the study would provide a more robust dataset, particularly in the stabilizer stratum, which we believe will be very important to patients, clinicians, and payers. This change has no expected impact on previously projected enrollment timelines or the Company’s projected cash runway. In May 2025 , the Company presented Phase 1 wild-type vs. variant ATTR-CM data at the Heart Failure 2025 Meeting in Belgrade, Serbia . The data showed that nex-z reduced TTR production and showed promise for treating both wild-type (ATTRwt) and variant (ATTRv) ATTR-CM with a favorable safety profile. Absolute TTR levels dropped from 222.4 to 16.5 μg/mL (ATTRwt) and 132.0 to 16.6 μg/mL (ATTRv). Functional capacity and clinical biomarkers were favorably impacted in both patient groups. Evidence of stability or improvement in disease progression markers were observed across both populations at similar rates. The most commonly reported treatment-related adverse events were IRR, which were mild or moderate, and did not result in any discontinuations. Observed liver enzyme abnormalities were not considered serious, were asymptomatic and resolved spontaneously without medical intervention or sequelae. Intellia expects to present longer-term data from ATTR-CM patients in the Phase 1 study in the second half of 2025. The data will include updated measures of clinical efficacy and safety. Hereditary ATTR Amyloidosis with Polyneuropathy (ATTRv-PN): Enrollment is ahead of schedule in the global Phase 3 MAGNITUDE-2 study. Intellia now expects enrollment to be completed in the first half of 2026. In May 2025 , the Company presented positive two-year follow-up Phase 1 data in an oral presentation at the 2025 Peripheral Nerve Society (PNS) Annual Meeting in Edinburgh, United Kingdom . Across patients who received a one-time dose of 0.3 mg/kg or higher (n=33), the mean serum TTR reduction by Day 28 was 90% (corresponding mean absolute serum TTR level of 23.8 µg/mL), with levels remaining virtually unchanged through at least 24 months. Among the 18 patients with 24 month mNIS+7 endpoint assessments, 13 showed improvements of ≥ 4 points, which is considered to be a clinically meaningful threshold. Most of the patients in the cohort who had progressed on patisiran improved, and only a single patient among the 18 had a deterioration of ≥ 4. Nex-z was generally well tolerated across all patients and at all dose levels tested. Treatment-related adverse events were consistent with those described for the cardiomyopathy population. In September 2025 , the Company will present interim Phase 1 extended data in a symposium at the 5th International ATTR Amyloidosis Meeting for Patients and Doctors in Baveno, Italy . ATTR Amyloidosis with Cardiomyopathy (ATTR-CM): Enrollment in the global Phase 3 MAGNITUDE trial is progressing ahead of the Company’s projections and the Company is tracking to enroll at least 650 patients cumulatively by year-end. Intellia is amending the MAGNITUDE study to expand enrollment to approximately 1,200 patients from 765 patients, subject to health authority review. Expanding the patient number in the study would provide a more robust dataset, particularly in the stabilizer stratum, which we believe will be very important to patients, clinicians, and payers. This change has no expected impact on previously projected enrollment timelines or the Company’s projected cash runway. In May 2025 , the Company presented Phase 1 wild-type vs. variant ATTR-CM data at the Heart Failure 2025 Meeting in Belgrade, Serbia . The data showed that nex-z reduced TTR production and showed promise for treating both wild-type (ATTRwt) and variant (ATTRv) ATTR-CM with a favorable safety profile. Absolute TTR levels dropped from 222.4 to 16.5 μg/mL (ATTRwt) and 132.0 to 16.6 μg/mL (ATTRv). Functional capacity and clinical biomarkers were favorably impacted in both patient groups. Evidence of stability or improvement in disease progression markers were observed across both populations at similar rates. The most commonly reported treatment-related adverse events were IRR, which were mild or moderate, and did not result in any discontinuations. Observed liver enzyme abnormalities were not considered serious, were asymptomatic and resolved spontaneously without medical intervention or sequelae. Intellia expects to present longer-term data from ATTR-CM patients in the Phase 1 study in the second half of 2025. The data will include updated measures of clinical efficacy and safety. Hereditary ATTR Amyloidosis with Polyneuropathy (ATTRv-PN): Enrollment is ahead of schedule in the global Phase 3 MAGNITUDE-2 study. Intellia now expects enrollment to be completed in the first half of 2026. In May 2025 , the Company presented positive two-year follow-up Phase 1 data in an oral presentation at the 2025 Peripheral Nerve Society (PNS) Annual Meeting in Edinburgh, United Kingdom . Across patients who received a one-time dose of 0.3 mg/kg or higher (n=33), the mean serum TTR reduction by Day 28 was 90% (corresponding mean absolute serum TTR level of 23.8 µg/mL), with levels remaining virtually unchanged through at least 24 months. Among the 18 patients with 24 month mNIS+7 endpoint assessments, 13 showed improvements of ≥ 4 points, which is considered to be a clinically meaningful threshold. Most of the patients in the cohort who had progressed on patisiran improved, and only a single patient among the 18 had a deterioration of ≥ 4. Nex-z was generally well tolerated across all patients and at all dose levels tested. Treatment-related adverse events were consistent with those described for the cardiomyopathy population. In September 2025 , the Company will present interim Phase 1 extended data in a symposium at the 5th International ATTR Amyloidosis Meeting for Patients and Doctors in Baveno, Italy . Enrollment in the global Phase 3 MAGNITUDE trial is progressing ahead of the Company’s projections and the Company is tracking to enroll at least 650 patients cumulatively by year-end. Intellia is amending the MAGNITUDE study to expand enrollment to approximately 1,200 patients from 765 patients, subject to health authority review. Expanding the patient number in the study would provide a more robust dataset, particularly in the stabilizer stratum, which we believe will be very important to patients, clinicians, and payers. This change has no expected impact on previously projected enrollment timelines or the Company’s projected cash runway. In May 2025 , the Company presented Phase 1 wild-type vs. variant ATTR-CM data at the Heart Failure 2025 Meeting in Belgrade, Serbia . The data showed that nex-z reduced TTR production and showed promise for treating both wild-type (ATTRwt) and variant (ATTRv) ATTR-CM with a favorable safety profile. Absolute TTR levels dropped from 222.4 to 16.5 μg/mL (ATTRwt) and 132.0 to 16.6 μg/mL (ATTRv). Functional capacity and clinical biomarkers were favorably impacted in both patient groups. Evidence of stability or improvement in disease progression markers were observed across both populations at similar rates. The most commonly reported treatment-related adverse events were IRR, which were mild or moderate, and did not result in any discontinuations. Observed liver enzyme abnormalities were not considered serious, were asymptomatic and resolved spontaneously without medical intervention or sequelae. Intellia expects to present longer-term data from ATTR-CM patients in the Phase 1 study in the second half of 2025. The data will include updated measures of clinical efficacy and safety. Enrollment is ahead of schedule in the global Phase 3 MAGNITUDE-2 study. Intellia now expects enrollment to be completed in the first half of 2026. In May 2025 , the Company presented positive two-year follow-up Phase 1 data in an oral presentation at the 2025 Peripheral Nerve Society (PNS) Annual Meeting in Edinburgh, United Kingdom . Across patients who received a one-time dose of 0.3 mg/kg or higher (n=33), the mean serum TTR reduction by Day 28 was 90% (corresponding mean absolute serum TTR level of 23.8 µg/mL), with levels remaining virtually unchanged through at least 24 months. Among the 18 patients with 24 month mNIS+7 endpoint assessments, 13 showed improvements of ≥ 4 points, which is considered to be a clinically meaningful threshold. Most of the patients in the cohort who had progressed on patisiran improved, and only a single patient among the 18 had a deterioration of ≥ 4. Nex-z was generally well tolerated across all patients and at all dose levels tested. Treatment-related adverse events were consistent with those described for the cardiomyopathy population. In September 2025 , the Company will present interim Phase 1 extended data in a symposium at the 5th International ATTR Amyloidosis Meeting for Patients and Doctors in Baveno, Italy . Platform and Company Updates Intellia is pioneering novel CRISPR-based gene editing technologies, such as gene writing and extrahepatic lipid nanoparticle (LNP) delivery technologies, to create highly differentiated in vivo and ex vivo product candidates. The Company’s proprietary platform technologies are being researched and developed to expand therapeutics opportunities to support the mission of transforming lives of people with severe diseases, including the possibility of curative genome editing therapeutics. Intellia has expanded its commercial and medical affairs teams to build a strong foundation for commercial readiness. Since the beginning of the year, the company welcomed two key leaders: Jim McNinch, Vice President, U.S. Head of Sales and Ben Newman , Vice President, Commercial Operations, as well as several additional senior leaders with responsibilities for commercial data and field operations, marketing, pricing, patient services, market access, forecasting and medical communications. The company has largely completed the buildout of the commercial and medical affairs leadership teams. Upcoming Events The Company will participate in the following events during the third quarter of 2025: Citi 2025 Biopharma Back to School Conference , Sept. 3 , Boston Wells Fargo Health Care Conference , Sept. 4 , Boston Bernstein Healthcare Forum , Sept. 23 , New York 5th International ATTR Amyloidosis Meeting for Patients and Doctors, Sept. 25-26 , Baveno, Italy Second Quarter 2025 Financial Results Cash Position: Cash, cash equivalents and marketable securities were $630.5 million as of June 30, 2025 , compared to $861.7 million as of December 31, 2024 . The decrease in cash, cash equivalents and marketable securities includes approximately $65.0 million of non-recurring cash payments in the first half of 2025 associated with the Company’s previously announced portfolio prioritization, workforce reduction, and real estate consolidation. The Company’s cash, cash equivalents and marketable securities as of June 30, 2025 are expected to fund operations into the first half of 2027 and into the anticipated first commercial launch. Collaboration Revenue: Collaboration revenue was $14.2 million during the second quarter of 2025, compared to $6.9 million during the second quarter of 2024. The $7.3 million increase was mainly driven by cost reimbursements related to our collaboration with Regeneron Pharmaceuticals, Inc. R&D Expenses: Research and development (R&D) expenses were $97.0 million during the second quarter of 2025, compared to $114.2 million during the second quarter of 2024. The $17.2 million decrease was primarily driven by employee-related expenses, stock-based compensation, research materials and contracted services offset by an increase in the advancement of our lead programs. Stock-based compensation expense included in R&D expenses was $14.1 million for the second quarter of 2025. G&A Expenses: General and administrative (G&A) expenses were $27.2 million during the second quarter of 2025, compared to $31.8 million during the second quarter of 2024. The $4.6 million decrease was primarily related to lower stock-based compensation, offset in part by increased expenses related to the ongoing buildout of our commercial infrastructure. Stock-based compensation expense included in G&A expenses was $8.0 million for the second quarter of 2025. Net Loss: Net loss was $101.3 million for the second quarter of 2025, compared to $147.0 million during the second quarter of 2024. Conference Call to Discuss Second Quarter 2025 Results The Company will discuss these results on a conference call today, Thursday, August 7 at 8 a.m. ET . To join the call: U.S. callers should dial 1-833-316-0545 and international callers should dial 1-412-317-5726, approximately five minutes before the call. All participants should ask to be connected to the Intellia Therapeutics conference call. Please visit this link for a simultaneous live webcast of the call. A replay of the call will be available through the Events and Presentations page of the Investors & Media section on Intellia’s website at intelliatx.com, beginning on August 7 at 12 p.m. ET . About Intellia Therapeutics Intellia Therapeutics, Inc. (NASDAQ:NTLA) is a leading clinical-stage gene editing company focused on revolutionizing medicine with CRISPR-based therapies. Since its inception, Intellia has focused on leveraging gene editing technology to develop novel, first-in-class medicines that address important unmet medical needs and advance the treatment paradigm for patients. Intellia’s deep scientific, technical and clinical development experience, along with its people, is helping set the standard for a new class of medicine. To harness the full potential of gene editing, Intellia continues to expand the capabilities of its CRISPR-based platform with novel editing and delivery technologies. Learn more at intelliatx.com and follow us @intelliatx. Forward-Looking Statements This press release contains “forward-looking statements” of Intellia Therapeutics, Inc. (“Intellia” or the “Company”) within the meaning of the Private Securities Litigation Reform Act of 1995. These forward-looking statements include, but are not limited to, express or implied statements regarding Intellia’s beliefs and expectations concerning: the safety, efficacy, success and advancement of its clinical programs for nexiguran ziclumeran or “nex-z” (also known as NTLA-2001) for transthyretin (“ATTR”) amyloidosis and lonvoguran ziclumeran or “lonvo-z” (also known as NTLA-2002) for the treatment of hereditary angioedema (“HAE”) pursuant to its clinical trial applications (“CTA”) and investigational new drug application (“IND”) submissions, including the expected timing of data releases from its ongoing clinical trials of nex-z and lonvo-z, regulatory feedback, regulatory filings, and the enrollment, dosing and completion of clinical trials, such as completing randomization in the Phase 3 HAELO study in the third quarter of 2025 and submitting a biologics license application (“BLA”) for lonvo-z in the second half of 2026, its ability to enroll the Phase 3 MAGNITUDE study and enroll at least 650 patients cumulatively by the end of 2025, its ability to enroll the Phase 3 MAGNITUDE-2 study and complete enrollment in the first half of 2026, its plans to present new data from the ongoing Phase 1/2 study of lonvo-z and longer-term Phase 1 data of nex-z, including updated measures of clinical efficacy and safety, in the second half of 2025, the potential of nex-z to halt and reverse disease by driving a deep, consistent and potentially lifelong reduction in TTR protein after a single dose, and the potential of lonvo-z to provide lifelong control of HAE attacks after a single dose; its expectations that expanding the patient number in the Phase 3 MAGNITUDE study would provide a more robust dataset, particularly in the stabilizer stratum, and its belief that such dataset will be very important to patients, clinicians and payers, while having no expected impact on previously projected enrollment timelines or its projected cash runway; its ability to apply novel CRISPR-based gene editing technologies, such as gene writing, and extrahepatic lipid nanoparticle (“LNP”) delivery technologies to create highly differentiated in vivo and ex vivo product candidates, including its ability to use those technologies to expand therapeutic opportunities and the timing expectations of advancing such product candidates; its ability to build a strong foundation for commercial readiness through hiring certain senior leadership positions in its commercial and medical affairs organizations; its ability to optimize the impact of its collaborations on its development programs, including, but not limited to, its collaboration with Regeneron Pharmaceuticals, Inc. (“Regeneron”) and their co-development programs for ATTR amyloidosis; and its growth as a company and expectations regarding its uses of capital, expenses, future accumulated deficit and financial results, including its ability to fund operations into the first half of 2027 and into the first anticipated commercial launch. Any forward-looking statements in this press release are based on management’s current expectations and beliefs of future events and are subject to a number of risks and uncertainties that could cause actual results to differ materially and adversely from those set forth in or implied by such forward-looking statements. These risks and uncertainties include, but are not limited to: risks related to Intellia’s ability to protect and maintain its intellectual property position; risks related to Intellia’s relationship with third parties, including its contract manufacturers, collaborators, licensors and licensees; risks related to the ability of its licensors to protect and maintain their intellectual property position; uncertainties related to the authorization, initiation and conduct of preclinical and clinical studies and other development requirements for its product candidates, including uncertainties related to regulatory approvals to conduct clinical trials; risks related to the ability to develop and commercialize any one or more of Intellia’s product candidates successfully; risks related to the results of preclinical studies or clinical studies not being predictive of future results in connection with future studies; the risk that clinical study results will not be positive; risks related to the potential delay of planned clinical trials due to regulatory feedback or other developments; and risks related to Intellia’s collaborations with Regeneron, or its other collaborations not continuing or not being successful. For a discussion of these and other risks and uncertainties, and other important factors, any of which could cause Intellia’s actual results to differ from those contained in the forward-looking statements, see the section entitled “Risk Factors” in Intellia’s most recent annual report on Form 10-K, as well as discussions of potential risks, uncertainties, and other important factors in Intellia’s other filings with the Securities and Exchange Commission , including its quarterly report on Form 10- Q. All information in this press release is as of the date of the release, and Intellia undertakes no duty to update this information unless required by law. Intellia Contacts: Investors: Brittany Chaves Senior Manager, Investor Relationsbrittany.chaves@intelliatx.com Media: Matt Crenson Ten Bridge Communications media@intelliatx.com mcrenson@tenbridgecommunications.com Source: Intellia Therapeutics, Inc.

研究概述2025年5月28日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的韩雪祥研究员和美国宾夕法尼亚大学的Michael J. Mitchell教授团队在Small Methods期刊发表标题为“Lipid Nanoparticles for Delivery of CRISPR Gene Editing Components”的研究论文。该综述主要探讨了脂质纳米颗粒（LNPs）在体内递送CRISPR基因编辑组分的应用现状与挑战，系统分析了LNPs各组分（如离子化脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质）对其递送效率和基因编辑效率的影响，并总结了实现非肝脏靶向的LNP工程策略。全文20081字，建议收藏阅读。1. 引言基因编辑能够在细胞基因组的靶向序列中插入或删除DNA序列。成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统在临床前和早期临床研究的基因编辑中取得了巨大成功。最初，CRISPR/Cas9系统是细菌和古菌中的一种强大防御机制，保护这些生物免受病毒感染。当外源DNA入侵时，Cas9蛋白会切割外源DNA，而外源DNA则整合到宿主的CRISPR位点中，该位点以侧翼重复序列为特征。同时，从CRISPR位点立即转录出反式激活crRNA（tracrRNA）和crRNA。随后，由tracrRNA:crRNA双链和Cas9蛋白组成的复合体诱导双链断裂（DSB）。在II型CRISPR系统中，Cas9蛋白由单导向RNA（sgRNA）引导，二者共同组装成核糖核蛋白（RNP）复合体（图1a）。RNP在特定位点产生DSB，DSB通过两种过程之一进行修复：非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）。NHEJ产生的随机核苷酸插入或缺失（indels）可能导致移码突变，从而破坏基因功能，这一过程称为基因敲除。相比之下，HDR可以利用同源DNA模板或额外的单链寡核苷酸DNA（ssODN）精确修复断裂的DNA，从而插入特定序列，这一过程称为基因敲入。基因编辑在治疗方面展现出巨大潜力。基因编辑的首次临床应用是将经过CRISPR编辑的免疫细胞用于肺癌患者的治疗。最近，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首个CRISPR/Cas9基因编辑疗法——exagamglogene autotemcel（exa-cel），用于治疗镰状细胞病和β-地中海贫血，该疗法通过电穿孔患者造血干细胞来编辑BCL11A基因。总体而言，基因编辑工具为治疗以往无法治愈的疾病带来了希望。图1. CRISPR基因编辑策略概述。许多创新的CRISPR相关工具正在开发中，以期实现基因编辑的更好应用。碱基编辑器将失活的Cas核酸酶与DNA脱氨酶融合，以引入单核苷酸改变（图1b）。碱基编辑器分为两大类：胞嘧啶碱基编辑器（CBEs），将C•G碱基对转换为T•A碱基对；腺嘌呤碱基编辑器（ABEs），将A•T碱基对转换为G•C碱基对。碱基编辑器的准确性和安全性使其适合用于纠正与人类疾病相关的单核苷酸多态性。另一种基因组编辑技术是Prime编辑，它能够以精确的方式实现所有类型的单核苷酸变化、DNA序列插入或删除。Prime编辑器将Cas9切口酶结构域与工程化的逆转录酶结构域融合，允许基于Prime编辑引导RNA（pegRNA）模板合成DNA序列（图1c）。由于Prime编辑能够引入插入、删除以及所有类型的遗传替换，因此它有潜力纠正任何与遗传病相关的突变。总之，基因组编辑是一种强大且多功能的方法，能够在单次治疗后提供持久的治疗效果。安全、高效地将基因编辑工具递送至感兴趣的器官或细胞是基因编辑临床应用的主要瓶颈之一。为了克服这一障碍，人们开发并测试了多种递送技术，包括病毒载体和非病毒载体。尽管病毒载体（如慢病毒、腺病毒和腺相关病毒）在体内递送方面表现出色，但由于其对衣壳的免疫原性、潜在的致癌性、持续的Cas9表达以及有限的包装能力，限制了它们在基因编辑中的应用。非病毒载体具有显著优势，包括免疫原性低、能够防止基因整合以及高包装能力，更适合用于基因组编辑。本综述主要关注脂质纳米颗粒（LNPs），这是最先进的非病毒核酸递送平台。感兴趣的读者可以在其他地方找到关于其他非病毒载体的详细综述。siRNA-LNP药物（Onpattro）和两种COVID-19 mRNA-LNP疫苗的成功表明，LNPs是安全高效的载体，能够在体内递送各种治疗性核酸。当通过静脉注射给药时，LNPs可以吸收载脂蛋白E（ApoE），随后通过细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDLR）介导的内吞作用被肝细胞摄取。因此，大多数LNPs在肝脏中积累，使得通过LNPs介导的肝外基因编辑成为一个重大挑战。为了实现肝外基因编辑，需要开发具有高递送效率和特异性的新型LNPs。因此，本综述讨论了基于LNP的基因编辑的最新进展，以及LNP的四组分结构对递送和基因编辑效率的影响，进一步总结了LNP介导的肝外靶向的当前方法，这些方法对于肝外基因编辑可能具有前景。2. 脂质纳米颗粒LNPs作为一种非病毒载体，越来越受到关注，用于体内递送各种治疗性核酸。通常，LNPs由四个关键组分构成：可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质。在标准配方过程中，将溶解在乙醇中的脂质成分迅速与酸性溶液中的mRNA结合，使用微流控装置进行混合。尽管可以通过多种方法（如移液、涡旋和微流控混合）来制备LNPs，但由于LNPs的批次间可重复性，微流控混合是首选方法。然而，微流控混合难以与实验室小规模批次相协调，导致脂质材料和核酸的浪费。一般来说，对于高通量体外研究，推荐使用移液混合，而对于体内应用，则倾向于使用微流控混合。通过自组装过程中的静电吸引，负电荷的核酸与正电荷的可电离脂质结合，从而实现货物在LNPs中的封装。然后，mRNA-LNPs通过透析将其溶液与中性缓冲液交换后储存。由于LNP的组成显著影响递送和编辑效力，作者将分别讨论每个组分，希望为合理设计LNP以最大化基因编辑效率提供指导。2.1 可电离脂质可电离脂质在LNP配方过程中呈正电荷，以促进多聚阴离子mRNA的包载，而在血液循环中变为中性，以限制毒性。细胞摄取后，可电离脂质在酸性细胞器中质子化，产生内质网逃逸并将货物释放到细胞质中。最初，LNP配方使用了永久性阳离子脂质，但由于其降低了溶血活性并提高了递送效率，后来被可电离脂质所取代。可电离脂质由于其氨基头部基团带有正电荷，并且还包含连接链和疏水尾部。通常，可电离脂质的每个结构部分都影响LNPs的递送效率。根据结构，可电离脂质可以分为可生物降解、多尾、不饱和和支链等类型（图2）。目前，有两种策略用于合成可电离脂质：药物化学和组合化学。多步有机合成策略被广泛用于可电离脂质，涉及通过多次化学反应逐步组合可电离头部、连接链和疏水尾部。这种方法产生了DLin-MC3-DMA（图2）、SM-102（图2）和ALC-0315（图2）——所有这些都是用于临床产品的可电离脂质。然而，劳动密集型的合成和众多的纯化步骤导致了可电离脂质开发的巨大成本。为了解决这些挑战，Boldyrev等人成功简化了ALC-0315的合成路线。他们的方法简化了反应步骤，并提高了纯化过程的效率，从而实现了一种更高效、更具成本效益的生产方法。除了改进合成路线外，该领域还显著转向组合化学，用于快速合成可电离脂质。与传统方法相比，组合化学具有明显的优势，它允许在一步反应中从头部、连接链和疏水尾部组装可电离脂质。这简化了合成过程，并显著减少了工作量和时间。使用组合化学，研究人员可以快速生成具有多样化结构的可电离脂质库，然后筛选出具有高递送效率和低毒性的最佳脂质，用于后续的基因编辑研究。图2. 可电离脂质的分类。理想的可电离脂质应在释放有效载荷后立即降解，且其代谢产物对生物体无毒性。目前，引入了如酯键和二硫键等可生物降解连接链，以加速可电离脂质的代谢。TT3（图2）是一种多尾可电离脂质，首次封装了基因编辑所需的全部组分，在乙型肝炎病毒（HBV）感染的小鼠中降低了约40%的血清抗原水平。然而，由于TT3脂质具有不可降解的结构，因此不适合临床应用。通过还原胺化合成了多种TT3的可生物降解衍生物。例如，FTT5（图2）基于TT3脂质的结构进行了优化，在相同剂量下递送ABE mRNA/PCSK9 sgRNA时，其编辑效率比TT3提高了1.32倍。其他可电离脂质，包括L319、SM-102、ALC-0315、OF-Deg-Lin、CL4H6和93-O17S，均含有酯键，且大多数已被证明在递送基因编辑工具方面具有强大的效力。此外，二硫键作为一种非传统的可降解连接链，也可以通过还原性细胞内环境中的硫醇交换反应加速可电离脂质的降解。Xu等首次将二硫键引入可电离脂质。他们进一步筛选了通过改变不同胺基团合成的含有生物可还原二硫键的可电离脂质，并在文库中确定了表现最佳的脂质BAMEA-O16B（图2），该脂质能够在160 ng/mL的Cas9 mRNA浓度下，在HEK-GFP细胞中将绿色荧光蛋白（GFP）的表达降低90%。然而，仅实现了二硫键的部分裂解，这可能限制了它们的临床应用。Tanaka等发现，添加棕榈酸-4-甲基伞形酮酯可以加速含有二硫键的ssPalms脂质的代谢，通过颗粒内反应物的富集加速水解。表现最佳的不饱和可电离脂质ssPalmO-Phe（图2）在以0.75 mg/kg的剂量递送Cas9 mRNA/sgRNA后，实现了超过95%的转甲状腺素（TTR）降低。尽管含有二硫键的可电离脂质具有潜力，但它们的合成和纯化较为困难。此外，它们的过早降解和释放可能会限制它们的应用。总之，在选择用于体内基因编辑的可电离脂质时，需要考虑它们的可降解性。理论上，具有强膜破坏能力的可电离脂质可以将更多的基因编辑工具释放到细胞质中，从而提高编辑效率。因此，可电离脂质的快速优化仍然是一个重大挑战。脂质的构效关系（SAR）总结可以极大地促进这一优化过程。例如，CL4H6（图2）的设计得益于之前总结的SAR，并被应用于编辑HBV和TTR。Yusuke等发现，他们之前开发的pH敏感型不饱和阳离子脂质YSK12-C4（图2）的亲水头部基团可以影响其pKa值，这极大地影响了肝内分布和内质网逃逸。脂质的疏水尾部也会影响肝内分布。因此，他们基于SAR合理设计了理想的pH敏感型阳离子脂质CL4H6（图2），以实现期望的性能。在相同剂量下，CL4H6 LNP的编辑效率高于AAV2。同样，在发现cKK-E12（图2）、C12-200（图2）和246C10（图2）的过程中，也识别出了许多有价值的SAR，它们适用于基因编辑应用。SAR的总结是基于对众多不同结构的可电离脂质的合成和筛选。然而，合成具有独特结构的可电离脂质可能具有挑战性，这可能会阻碍筛选和优化过程。需要新的快速且成本效益高的构建方法。Han等开发了一种优雅的方法，使用一锅法、两步、三组分反应来合成具有扩展烷基支链的可降解支链可电离脂质，这些脂质通常难以合成。这种反应允许独立控制头部、主体、尾部和支链尾部，使其更容易总结SAR。他们确定了重要的设计规则，包括总尾碳数为18、对称尾结构以及与其他胺基团相隔2或3个碳原子的伯胺。选定的领先可电离脂质11-10-8（图2）用于基因编辑研究。11-10-8 LNP在1 mg/kg的剂量下实现了30%的TTR编辑，而FDA批准的MC3-LNP仅实现了约7%的TTR编辑。一般来说，可电离脂质的结构显著影响其编辑效率，使得可电离脂质的设计、优化和筛选至关重要。此外，对于具有独特结构的可电离脂质，开发更方便的合成方法是必要的。可电离脂质的SAR可以为指导下一代可电离脂质的设计提供宝贵的见解。2.2 磷脂磷脂，也称为辅助脂质，通常包含一个不可逆的两性离子和两个疏水尾部，能够介导LNP配方、膜融合和内质网逃逸。最常用的磷脂是饱和的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DSPC）（图3）和不饱和的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺（DOPE）（图3）。先前的研究表明，DSPC与胆固醇一起存在于空LNP的外层，而在载有RNA分子的LNP中则部分内化。所有商业LNP产品，包括mRNA-1273和BNT162b2 COVID-19疫苗，均含有DSPC，并展现出良好的稳定性。Kulkarni等同事表明，含有DSPC的配方在体外表现出比含有DOPE的配方更强的内吞作用。然而，在某些研究中，含有DOPE的LNP在mRNA递送效率和增强蛋白表达方面表现出色。当涉及到DNA递送时，含有DOPE的LNP更有效地促进DNA基遗传物质进入细胞。DSPC倾向于形成层状相，有助于稳定LNP结构，而DOPE则倾向于创造倒置六角形H（II）相，从而促进更大的内质网逃逸。Zhang等发现，含有DOPE的LNP倾向于在肝脏中积累，而DSPC则诱导更多的脾脏积累。因此，含有DOPE的配方可能更适合于肝脏基因编辑，而含有DSPC的配方可能更适合于脾脏免疫细胞的基因编辑。另一种天然存在于细胞膜中的磷脂是磷脂酰丝氨酸（PS），也可以用于LNP的制备。通过将脂肪酸链替换为亚油基团，合成了一系列可溶于乙醇的PS衍生物，以增加它们在乙醇中的溶解度，从而可以直接将PS纳入LNP中。含有PS的配方更倾向于被巨噬细胞摄取；这种配方可能适合于巨噬细胞编辑。磷脂的结构修饰对于提高递送效率也是必不可少的。Liu等开发了多尾可电离磷脂（iPhos），以克服传统磷脂的结构刚性。具有一个两性离子头部和三个烷基尾部的iPhos更有可能在内质网中形成锥形，随后促进膜的六角形转变和货物释放。他们发现，领先的iPhos，9A1P9（图3），比DSPC和DOPE的转染效率高出40倍和965倍。此外，9A1P9在脾脏基因编辑方面表现出最高的水平，并且能够在0.75 mg/kg的剂量下编辑28.3%的PTEN细胞。在另一项研究中，Gan等发现，在磷脂中引入金刚烷基团可以使LNP选择性地靶向肝脏中的免疫细胞，表明了细胞特异性基因编辑的可能性。总的来说，选择磷脂时应谨慎考虑，以最大化特定细胞类型的转染和编辑效率。图3. 甾醇、磷脂和PEG-脂质的代表性结构。2.3 胆固醇胆固醇作为细胞膜的天然成分，可以稳定LNP并增加内质网逃逸。LNP配方中胆固醇的比例可以影响递送效率，随着胆固醇含量的增加，货物释放得到改善。β-谷甾醇是一种天然存在的植物甾醇，与胆固醇配方的LNP相比，显示出更高的转染效率。Patel等观察到，通过活细胞成像，β-谷甾醇-LNP配方在内吞体小泡中的保留时间延长，从而增强了内质网逃逸。此外，含有β-谷甾醇的MC3 LNP显示出比含有胆固醇的LNP更高的基因编辑效率，这是由于增强了Cas9 mRNA的释放。Palanki等表明，与胆固醇相比，基因编辑在β-谷甾醇中得到了增强，表明β-谷甾醇可能更适合用于递送基因编辑工具。除了这一点，胆固醇衍生物也被用于LNP的配方中。例如，3β[L-组氨酸酰胺-氨基甲酸酯]胆固醇衍生脂质增强了LNP的递送。同样，阳离子胆固醇双子体也表现出卓越的效率。此外，研究人员发现，胆固醇类似物有助于开发无胆固醇的LNP，这可能改善肿瘤细胞的摄取并促进内质网逃逸。此外，用其他类似物配方的LNP已显示出肝外递送的能力，可能使基因编辑超出肝脏。胆固醇的结构修饰也是必不可少的。Kalina等注意到，含有20α-羟基胆固醇（图3）的LNP优先将mRNA靶向内皮细胞和库普弗细胞，而不是肝细胞，从而为这些特定细胞类型的基因编辑提供了新的途径。他们进一步探索了胆固醇的酯化，并确定含有胆固醇油酸酯的LNP可以有效地将货物递送到肝内皮细胞中，在体内导致这些细胞中41%的GFP编辑。另一项研究表明，部分用7α-羟基胆固醇（图3）替代胆固醇可以减少LNP的内质网回收，从而改善mRNA递送。由于胆固醇衍生物可以影响LNP的递送效率和趋向性，不同的衍生物可以导致增强的或细胞/组织特异性的基因编辑。因此，选择胆固醇或其衍生物应谨慎考虑。2.4 PEG-脂质LNPs通常包含1-2.5摩尔%的PEG-脂质，占总脂质的比例，由于其亲水性，它们位于LNPs的外层。它们可以形成一个屏障，防止纳米颗粒聚集以及被单核吞噬细胞系统清除。LNPs中不同比例的PEG-脂质会影响表面电荷和粒径，最终影响LNPs在体内的趋向性和效力。Kim等发现，含有5% PEG-脂质的LNPs比含有1.5% PEG-脂质的LNPs与ApoE的结合亲和力更低。因此，PEG的比例对于有效递送至关重要，因为过量的PEG-脂质可能会阻碍LNPs与血清蛋白之间的相互作用。此外，PEG层可以减少LNPs在直接给药到气管时在粘液中的布朗运动，从而增强脂质纳米颗粒的稳定性。然而，这一层也会抑制内吞作用和内质网逃逸。总的来说，应选择适当的PEG脂质比例以实现有效递送。DMG-PEG2000（图3）和ALC-0159（图3）分别用于Onpattro（patisiran）、mRNA-1273和BNT162b2。它们都由一个亲水的PEG链和两个各有14个碳原子的烷基链组成。2013年，Mui等发现，与短链烷基的PEG-脂质相比，长链烷基的PEG-脂质可以延长LNPs的循环时间。长循环的LNPs允许更多的基因编辑有效载荷被递送到非肝脏细胞中，以实现有效的靶向编辑。有趣的是，Palanki等发现，使用中性PEG-脂质可以实现更高的编辑效率，这可能归因于PEG-脂质与封装的mRNA货物之间较少的电荷相互作用。为了实现最佳的基因编辑，PEG-脂质的结构优化是必不可少的。尽管PEG-脂质在LNPs中发挥着重要作用，但预先存在的抗PEG抗体可能会加速LNPs的清除，并可能引发超敏反应，引发对其效力和安全性的担忧。抗PEG抗体可能会阻碍LNPs在基因组编辑中的临床应用。为了解决这些问题，可以考虑优化PEG-脂质的结构以减少免疫反应，并加入抗炎基团。2.5 其他辅料传统的LNPs通常由四种成分组成。然而，一些研究引入了额外的第五种成分，以提高LNPs的转染和趋向性。Ma等发现，向LNPs中添加单宁可以改善LNP的内质网逃逸，因为它们对核酸具有高亲和力。同样，加入聚（γ-谷氨酸）可以促进货物（如mRNAs、Cas9 RNPs或siRNAs）的释放，从而将编辑效率提高了两倍。透明质酸（HA）是CD44受体的天然配体之一，因此HA包覆的LNPs主要被肿瘤摄取和内化。第五种成分也可以用来增强mRNA翻译。在缺氧条件下，研究人员发现mRNA翻译比正常条件下减少，这与细胞内低水平的三磷酸腺苷（ATP）有关。为了解决这一问题，Ma将ATP作为LNP的额外成分，为细胞提供额外的能量，这导致在体外mRNA编码蛋白表达增加了79倍，在体内增加了24倍，与普通LNPs相比。如果递送的是mRNA形式，这种策略可以应用于增强基因编辑效果。额外的成分也可以用来调节LNPs的表面电荷以实现器官趋向性。例如，Cheng等发现，引入额外的永久性阳离子脂质可以实现肺部靶向，而引入负电荷脂质则导致脾脏趋向性。这些LNPs被称为SORT LNPs。在另一项研究中，Han等开发了一种新型的含有脒基的可降解脂质，作为第五种成分，通过改变表面电荷，将肝靶向LNPs重新定向到肺部或脾脏。总的来说，添加第五种成分可能是提高基因编辑效率和修改LNPs趋向性以靶向特定组织和细胞的有希望的策略。然而，必须考虑到LNPs的复杂性增加，以实现转化应用。3. 非肝脏靶向策略由于LNPs具有内在的肝脏趋向性，静脉注射后通常会在肝脏中积累，这限制了基因编辑工具向非肝脏器官的递送。在本节中，作者将总结使LNPs能够靶向肝外组织的各种方法，这可能为超出肝脏的基因编辑提供见解。这些方法包括利用特定的给药途径、改变LNPs的物理化学性质、使用具有细胞/组织选择性的可电离脂质以及在LNPs上缀合靶向基团。3.1 利用特定给药途径从静脉注射转变为局部给药提供了一种直接的方法，以避免LNPs的内在肝脏积累，同时增加靶向器官中的局部浓度（图4a）。例如，LNPs可以直接注入目标部位，如肿瘤内注射。由于肿瘤的高细胞外基质密度和血管组织不良，封装的基因编辑工具可以在肿瘤内被物理限制。例如，Rosenblum等通过肿瘤内注射递送靶向PLK1的Cas9 mRNA和sgRNA，实现了约70%的基因编辑效率。然而，这种方法主要用于易于接触的表浅肿瘤。肿瘤微环境，其特征是密集的细胞外基质、固体应力和异常的血管结构，可以显著阻碍纳米颗粒在肿瘤内的积累。只有约0.7%的注射纳米颗粒能够到达实体肿瘤。为了提高递送效率，已经开发了多种策略。研究重点是优化纳米颗粒的各种参数，包括大小、形状、表面化学和刚度，以增强在肿瘤部位的积累。总体而言，优化LNPs以增强在肿瘤部位的渗透是至关重要的。图4. 实现脂质纳米颗粒（LNPs）非肝脏靶向的策略。对于肺部基因编辑，雾化被认为是一种最佳方法，因为它可以最小化对其他器官的非靶向效应，并允许直接进入肺部系统。然而，确保LNPs在雾化过程中的稳定性以及有效穿透粘液对于成功递送至肺部至关重要。几项研究通过将可电离脂质替换为阳离子脂质或将胆固醇替换为β-谷甾醇，调整了LNP配方，与原始LNPs相比，显示出改善的肺部LNPs递送效果。最近，Jiang等发现，额外的亲水性聚合物辅料bPEG20K可以帮助抵抗雾化诱导的LNPs聚集，从而改善肺部递送。总体而言，这些策略可能适用于增强雾化LNPs的基因编辑效果。在小鼠视网膜中成功实现了基因编辑，通过局部给药的脂质封装RNP，突出了其在治疗眼科疾病中的潜力。无论是通过视网膜下注射还是玻璃体内注射，LNPs都难以穿透神经视网膜，且蛋白表达主要局限于吞噬性视网膜色素上皮细胞和Müller胶质细胞，这限制了在光感受器中的基因编辑。因此，开发更高效的LNPs或与抗体缀合以实现更深入的眼部递送是至关重要的。在血脑屏障的情况下，脑室内注射提供了一种绕过这一屏障的方法，使LNPs能够更有效地到达围产期大脑。优化的LNP配方可以增加胎儿和新生小鼠大脑中的转染能力，在Idua G→A（W392X）小鼠中显示出成功的编辑。当通过肌肉内或皮下注射给药时，LNPs主要分布在注射部位和淋巴结，这些部位已被有效地用于在mRNA疫苗的背景下引发对抗原的免疫反应，也可能适用于基因编辑应用。总之，局部给药仍然是将LNPs递送至特定靶器官和组织的最直接方法。3.2 改变LNPs的物理化学性质除了直接给药途径外，LNPs的物理化学性质显著影响其靶向能力。通常，LNPs呈中性且大小约为100纳米；这些特性使它们易于通过肝脏窦状隙的筛孔过滤，并随后被肝细胞摄取。因此，通过改变LNPs的物理化学性质（图4b），可以实现肝外靶向。注射的LNPs在肝脏和其他器官中的比例高度依赖于LNPs的大小。当45纳米的LNPs静脉注射时，70%的LNPs被发现在肝脏中。相比之下，1到3微米之间的纳米颗粒适合于肺部给药，因为肺部更容易接近。然而，使用微流控技术生成如此大的LNPs是困难的。LNPs的表面电荷也对生物分布起着关键作用。几项研究表明，带正电荷的LNPs倾向于在肺部定位，而带负电荷的LNPs则倾向于在脾脏中积累。LNPs的表面电荷与pKa值密切相关。补充了可电离脂质的SORT LNPs，靶向肝脏的pKa值为6-7，靶向肺部（补充了阳离子脂质的SORT LNPs）的pKa值大于9，靶向脾脏（补充了阴离子脂质的SORT LNPs）的pKa值在2到6之间。有趣的是，他们观察到这三种SORT LNPs吸收的血清蛋白是不同的。靶向肝脏的SORT LNPs主要富含ApoE，而靶向脾脏和肺部的LNPs则分别富含β2-糖蛋白I和维生素素。因此，SORT-脂质通过改变LNPs的表观pKa值和吸收的血清蛋白来赋予器官选择性。SORT LNPs在肺部表现出持续的基因编辑，并在可激活的tdTomato小鼠中实现了超过70%的肺干细胞编辑，显示出治愈相关疾病的可能性。值得注意的是，通过调整LNPs的物理化学性质来实现肝外靶向是一种简便的技术，然而，LNPs只能到达有限的器官（例如肺部和脾脏），并且增加了组分的复杂性。3.3 使用具有细胞/组织选择性的可电离脂质作为LNPs的关键成分，可电离脂质的化学结构可以影响LNPs对特定器官和细胞类型的内源性靶向（图4c）。Zhao等报道，含有咪唑的可电离脂质在T淋巴细胞转染中特别有效，其领先脂质93-O17S配方的LNPs分别在体内转染了8.2%和6.5%的CD4和CD8脾脏T淋巴细胞。此外，哌嗪环可以赋予LNPs脾脏趋向性。含有哌嗪环的LNP-A10是效果最好的LNP，可以转染50%的库普弗细胞、23%的脾脏巨噬细胞和26%的脾脏树突状细胞。总体而言，使用具有特定结构的可电离脂质配方的LNPs可能有助于体外/体内免疫细胞的基因组编辑。OF-Deg-Lin是另一种独特的可电离脂质，它被证明可以在体内转染脾脏B淋巴细胞（约7%）。有趣的是，尽管OF-Deg-Lin LNPs可以将mRNA递送到肝脏，但这些LNPs未能诱导蛋白质产生。这可能是由于与其它器官相比，这些LNPs在肝脏中的降解速度更快。因此，合理设计的可降解酯键在可电离脂质中可能有助于实现超出肝脏的靶向mRNA递送。除了脾脏，一些可电离脂质可以靶向肺部。例如，聚合物-脂质7C1显示出对肺部内皮细胞的强烈趋向性，将治疗性RNA递送到异常的内皮细胞中。有趣的是，Qiu等发现，含有酰胺键的N系列可电离脂质可以通过改变吸收的蛋白冠来实现肺部选择性的mRNA递送。领先的肺部靶向306-N16B配方的LNP富含血清白蛋白、纤维蛋白原β链和纤维蛋白原γ链，这与肝脏靶向LNP不同。在306-N16B LNP的情况下，33.6%的肺部内皮细胞成功转染；相比之下，只有1.5%的上皮细胞和1.9%的巨噬细胞被转染。此外，含有两性离子氨基脂质ZA3-Ep10（图2）的LNP，其含有磺基甜菜碱头部基团，也显示出肺部趋向性。值得注意的是，尽管这些LNPs表现出肺部趋向性，但它们仍然不如局部给药（例如吸入）那么特异性，如前所述。然而，通过在可电离脂质中引入特定结构，合理设计的可电离脂质有望实现器官选择性靶向。一种促进这些可电离脂质筛选的策略涉及DNA或mRNA条形码技术。Dahlman等首次使用DNA条形码在体内筛选LNPs，他们发现含有80 mol% 7C1和15-20 mol% C18PEG2000或80 mol% 7C1和0.1-10 mol%胆固醇的LNPs显示出骨髓内皮细胞趋向性。设计具有细胞/组织趋向性的可电离脂质的另一种有效方法是引入与细胞或组织中高表达的受体具有强亲和力的配体。Ma等基于神经递质可以通过主动运输穿过血脑屏障的事实，开发了一系列神经递质衍生的脂质。他们发现，色胺衍生的可电离脂质可以有效地将货物递送到大脑。在另一项研究中，用双膦酸盐（BPs）修饰的可电离脂质已被证明可以靶向骨骼，因为BPs对骨骼表面具有很强的结合亲和力。领先的BP修饰的可电离脂质490BP-C14配方的LNP在骨微环境中实现了更多的积累，并与未修饰的LNPs相比增强了mRNA表达。与MC3 LNP相比，配体缀合的可电离脂质也被报道可以靶向肝星状细胞。由于苯甲酰胺与sigma受体之间的相互作用，苯甲酰胺缀合的可电离脂质可以选择性地靶向过表达sigma受体的活化成纤维细胞。领先的可电离脂质AA-T3A-C12配方的LNPs与MC3 LNPs相比，显示出改善的siRNA递送能力，这可能潜在地用于将基因编辑工具递送到活化的成纤维细胞。总体而言，具有特定结构的可电离脂质可以赋予器官或细胞趋向性，这由于LNP配方的简单性而具有前景。3.4 在LNPs上缀合靶向基团除了LNPs固有的靶向能力外，表面修饰靶向基团（如抗体、肽和核酸适配体）可以增强与靶细胞上的抗原或受体的相互作用，从而实现特定的肝外器官靶向。目前，已经采用了几种修饰方法，将抗体与LNPs表面的反应性PEG-脂质缀合。在第一种方法中，还原抗体中的游离硫醇可以通过马来酰亚胺-硫醇化学与马来酰亚胺-PEG-脂质反应以实现缀合，这种方法在温和条件下易于操作。需要注意的是，反应时间和比例会影响缀合效率。使用这种方法开发了靶向造血干细胞（HSCs）的抗CD117-LNPs和靶向T细胞的抗CD3-LNPs。Billingsley等去除了抗体的潜在炎症Fc区域，并将Fab片段与马来酰亚胺-LNPs缀合以靶向泛T细胞标记物，突出了Fab片段的价值。第二种方法使用Diels-Alder反应，其中将赖氨酸的环戊二烯衍生物引入抗体，并与马来酰亚胺-PEG-脂质反应以实现抗体缀合。Diels-Alder反应被用来将血浆膜囊泡相关蛋白1与LNPs缀合，以增强洞穴体介导的内吞作用。与使用马来酰亚胺-硫醇方法相比，这种方法显示出更大的LNP稳定性。第三种方法使用N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸酯（SATA）-马来酰亚胺缀合化学。在这种方法中，抗体用SATA功能化以产生硫醇基团，允许与马来酰亚胺-PEG-脂质缀合。这种方法已被用于生产靶向HSCs的抗CD117 LNPs、靶向内皮细胞的抗CD31 LNPs以及靶向T细胞的抗CD4 LNPs和抗CD5 LNPs。封装腺嘌呤碱基编辑系统的抗CD117-LNPs可以在10 pg/细胞的剂量下拯救88%的镰状细胞病HSCs。第四种方法使用重组蛋白将抗体Fc域与LNPs缀合，这已被证明可以改善白细胞靶向。由于范围限制，此处未讨论用于抗体缀合的其他方法（例如点击化学）。尽管缀合抗体可以增强LNPs的靶向递送，但它引发了一些担忧。抗体的加入显著增加了LNPs的成本，并且需要额外的质量控制以确保一致性。由于额外的缀合和纯化步骤，抗体修饰的LNPs通常显示出较低的载药效率。因此，优化缀合方法以提高LNPs与抗体的比例至关重要。此外，抗体的免疫原性是一个不能忽视的关键考虑因素。与抗体缀合相比，肽缀合可以降低成本和免疫原性，使其成为更安全的替代品。pMHCI分子修饰的LNP可以靶向CD8+ T细胞，而RGD肽的缀合使LNPs能够靶向肿瘤。然而，重要的是要注意，缀合的抗体和肽仍然可能导致过敏反应或其他免疫相关不良反应。此外，非靶向效应可能导致其他不良反应。核酸适配体是另一种与受体具有独特3D结构的高亲和力基团。富含G的序列的LNPs倾向于被运输到脾脏。同样，修饰有针对上皮细胞粘附分子（EpCAM）的核酸适配体的LNPs可以有效地将CRISPR质粒递送到EpCAM基因，与裸质粒相比，在体内显示出优越的肿瘤抑制效果。此外，已经证明与特定核酸适配体缀合的LNPs可以靶向肿瘤。然而，核酸适配体的不稳定性可能限制了它们的广泛应用。缓解这一问题的一个有效方法是使用核酸修饰的核酸适配体。此外，核酸适配体也表现出一些交叉反应性。为了克服这些限制，小分子已被用来改变LNPs的趋向性。研究表明，与葡萄糖偶联可以促进LNPs在禁食后穿过血脑屏障。然而，这种方法是有限的。由于大脑中腺苷受体的高表达，Xiao等表明，当在创伤性脑损伤期间血脑屏障被破坏时，腺苷缀合的LNPs可以将有效载荷递送到大脑。然而，小分子配体与受体之间的相互作用通常较弱。尽管表面缀合靶向基团扩大了LNPs的应用范围，但实现非肝脏趋向性仍然受到缀合反应的变异性、成本和对细胞兴趣的特异性的限制。因此，进一步优化LNPs的组成，无论是体外还是体内，对于实现非肝脏递送都是至关重要的。4. LNP在基因编辑中的应用LNPs因其在体内递送基因编辑工具而受到欢迎。基于LNP的基因编辑目前已被用于多项临床试验，并已成为许多体内基因编辑应用的理想非病毒递送平台。由于吸收了ApoE脂蛋白，大多数通过静脉注射给药的LNPs被肝脏摄取。因此，LNPs主要用于将基因编辑工具递送到肝脏，而肝外递送仍然是LNPs的一个重大挑战。上述总结了几种用于非肝脏递送的方法。尽管并非所有方法都已用于非肝脏基因编辑，但它们仍然可以作为参考。在递送基因编辑工具时，应尽量减少非靶向效应。因此，递送载体和编辑工具应在基因编辑完成后暂时降解。可以由LNPs递送的基因编辑工具有三种形式，包括质粒、mRNA和RNP（图5）。在本节中，作者总结了通过递送这些有效载荷的基于LNP的基因编辑的最新进展（表1）。作者强调了Cas9 mRNA和sgRNA在基因编辑中的应用，并讨论了它们的修饰方法，这些方法可以作为后续选择作为货物的RNA以实现高翻译/编辑效率的参考。图5. 脂质纳米颗粒（LNP）介导的基因编辑工具递送的示意图。4.1 肝脏中的基因编辑4.1.1 基于LNP的CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是实现哺乳动物细胞基因组DNA特定位点基因编辑的强大工具。质粒的较大尺寸使其难以封装（图5a）。Zhang等开发了一种将质粒封装在LNPs内的方法，通过添加带有高密度阴离子电荷的原生质和软骨素硫酸盐，形成了与质粒稳定的负电荷核心。他们进一步将靶向PLK1的CRISPR/Cas9系统以质粒形式递送到活跃分裂的肿瘤细胞中，并实现了46.7%的生长抑制。然而，质粒在基因组编辑中更为复杂。因此，Cas9 mRNA/sgRNA和RNPs成为通过LNPs递送的主要货物。研究人员使用C12-200 LNP单独递送Cas9 mRNA，而CRISPR/Cas9系统的其余部分（即sgRNA和修复模板）则使用AAV8载体递送。这种共递送系统在fumarylacetoacetate hydrolase（FAH）突变小鼠中纠正了6.2%的肝细胞。未编辑的肝细胞最终可以被纠正编辑的肝细胞所取代，这有可能治愈遗传性酪氨酸血症I型。在另一项研究中，Lee等使用246C10 LNP-CRISPR-抗凝血酶（AT）和AAV供体敲除AT基因，并在同一位置敲入人类因子9基因，从而减少了67%的血清AT。这项研究表明，这种组合递送策略有可能治疗由凝血因子突变引起的血友病A和B。然而，LNPs和AAVs的结合并非理想，因为AAVs存在基因插入的潜在风险。因此，更多的研究集中在使用LNPs单独递送CRISPR/Cas9系统。与RNPs相比，Cas9 mRNA和sgRNA的组合在基因敲入和敲除过程中可能表现出更高的编辑效率，因为mRNA-LNPs应该更小，并且对降解酶有更好的保护（图5b）。LNPs可以单独递送Cas9 mRNA和sgRNA，也可以一起递送。Dong等使用他们之前设计的TT3 LNPs，由一个苯环、三个酰胺连接链和三个脂质链组成，分别递送针对PCSK9（sgPCSK9）的Cas9 mRNA和sgRNA，结果在小鼠中血清PCSK9减少了约50%。由于共递送显示出高编辑效率，并且比单独递送每个组分更简单，因此它已成为LNP介导基因编辑的主要方法。TT3 LNPs通过共递送CRISPR/Cas9系统，在HBV感染的小鼠中降低了约40%的抗原表达。上述讨论的SORT LNPs也显示出更大的肝脏特异性，并且可以共递送基因编辑系统。对于临床应用，LNPs的快速降解可以提高安全性，特别是在多次给药的情况下。Tanaka等使用可生物降解的ssPalmO-Phe LNPs递送CRISPR/Cas9系统，在0.75 mg/kg的剂量下，实现了超过95%的血清TTR降低。对于这一靶点，其他可生物降解的LNPs（例如11-10-8 LNP和LNP-INT01）也在基因编辑中证明了其可行性。此外，含有二硫键的可生物降解LNPs，如BAMEA-O16B-LNPs和306-O12B-LNPs，也包含二硫键。BAMEA-O16B-LNPs可以在9 mg/kg的剂量下将PCSK9降低到20%，而306-O12B-LNPs可以在血清中编辑血管生成素样3（Angptl3），血清减少65.2%。商业可得的可生物降解SM-102 LNP显示出其在AAV-HBV1.04小鼠中递送Cas9 mRNA和sgHBV的潜力，且无非靶向编辑。此外，这种治疗分别在1.5 mg/kg的剂量下，将HBcAg、HBsAg和cccDNA分别减少了53%、73%和64%，表明基因编辑疗法可以有效地清除cccDNA。这些结果表明，LNPs可以安全地将基因编辑工具递送到HBV感染的肝细胞中，有可能清除病毒。此外，LNPs加速了基因编辑疗法的转化应用，以治愈棘手的疾病。246C10 LNP-CRISPR系统显示出治疗血友病的潜力，并在血友病A小鼠中导致血清mAT浓度减少了40%，在血友病B小鼠中减少了70%，并且在1.2 mg/kg的剂量下增强了凝血酶的生成。RNPs可以在核转移后直接诱导DNA切割，绕过了Cas9 mRNA翻译和Cas9蛋白与sgRNA组装的步骤（图5c）。因此，它适用于快速基因编辑。此外，使用RNPs显示出比其他货物格式更少的非靶向效应和更低的免疫原性。然而，RNPs容易在酸性溶液中变性，这使得它们难以封装到LNPs中。为了解决这一问题，Wei等在LNP配方中引入了一种额外的阳离子脂质，以允许在中性pH下封装RNPs，这大大减少了RNPs的变性。此外，Walther等同事发现，不同的中性缓冲液可以影响RNPs，表明需要合适的缓冲液。Suzuki等通过添加ssODNs使RNP带有负电荷，从而通过sgRNAs和ssODNs之间的碱基配对形成来赋予RNP负电荷。他们使用CL4H6-LNP在HBV感染的细胞中进行基因编辑，减少了80%的共价闭合环状DNA（cccDNA）。此外，他们发现sgRNA和ssODN之间的熔解温度会影响体内基因编辑效率，强调了合适的熔解温度的重要性。在接近室温时，基于CL4H6-LNP的RNP系统显示出最高的敲除活性，并在2 mg RNP/kg的剂量下，在小鼠中实现了约80%的TTR敲除。总体而言，LNPs展示了将CRISPR/Cas9系统的各种形式高效递送到肝脏的能力。4.1.2 基于LNP的碱基编辑器和Prime编辑虽然CRISPR/Cas9系统可以在基因组DNA的特定位点进行基因改变，但碱基编辑器和Prime编辑器可以在不引入DSBs的情况下实现精确编辑。Zhang等使用FTT5 LNPs递送ABE，并在1 mg/kg的剂量下纠正了60%的突变PCSK9基因。SM-102 LNP也被用于通过封装ABE来编辑两种突变类型的苯丙氨酸羟化酶（PAH），从而减少了血清苯丙氨酸水平。同样，C12-200 LNPs递送了针对酪氨酸代谢途径中的一种酶——fumarylacetoacetate hydrolase（FAH）的codon-optimized ABE6.3 mRNA和sgRNA。然而，在本研究中只有0.44%的肝细胞被编辑。由于编辑率较低，作者尝试使用带有5-甲氧基尿嘧啶和加帽的化学修饰的ABE6.3 mRNA来增加其稳定性，最终显示出广泛的FAH阳性斑点。碱基编辑器也已应用于HBV感染，作为专有的LNPs被用来封装针对HBV不同部分的CBE mRNA和两个sgRNAs，在HBV小鼠中没有观察到HBV病毒反弹，与恩替卡韦治疗相比。与其他HBV治疗方式相比，基因编辑疗法理论上可以永久治愈疾病。因此，具有高递送效率的LNPs值得进一步研究，以在低剂量和低毒性下消除cccDNA。α1-抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）是一种由α1-抗胰蛋白酶（AAT）中的致病突变引起的难治性疾病，可以通过碱基编辑器永久治愈。已经采用了两种策略来修复AAT的功能丧失，包括直接纠正致病突变或引入另一个补偿性突变以恢复AAT。Packer等发现直接编辑更为有效。因此，他们开发了基于LNP的基因编辑药物BEAM-302来纠正AAT。除了小鼠外，还有两个团队在非人类灵长类动物中验证了基于LNP的基因编辑系统的安全性和有效性。Wu等将ABE8.8 mRNA和sgPCSK9封装在具有肝脏趋向性的专有LNPs中。sgRNA被设计为保留内含子1，PCSK9的翻译在此处终止。在一项长期研究中，血浆PCSK9和LDL-C的水平在八个月内稳定减少了约90%和60%。LNPs和ABE mRNA在两周内被清除，且未发现非靶向编辑。代表肝脏功能的酶，即天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶，暂时升高并恢复到基线水平。他们首次在非人类灵长类动物中评估了基于LNP的碱基编辑器的安全性和可行性，从而加速了LNP递送基因编辑工具的临床应用。在另一项研究中，Tan等也使用LNPs递送基因编辑工具，在1.5 mg/kg的剂量下，猕猴的血浆PCSK9和LDL水平分别稳定减少了32%和14%。这些有希望的临床前结果表明，LNPs可以在未来用于介导体内肝脏基因编辑。Prime编辑是一种全面的基因组编辑技术，能够精确插入、删除以及纠正所有类型的点突变。Jiang等使用他们优化的LNP介导的Prime编辑，在酪氨酸血症I型小鼠模型中纠正了0.76%的突变FAH肝细胞，突出了Prime编辑在纠正遗传疾病中的潜力。当选择Prime编辑时，必须考虑PE mRNA（约6.5 kb长），这可能导致在可电离脂质和RNA之间形成共价加合物时更高的降解概率和降低的翻译。基于LNP的Prime编辑系统已被用于敲除细胞中报告基因的终止密码子，表明Prime编辑可以由LNPs递送并正常发挥作用。此外，Herrera-Barrera等同事发现，LNPs在低pH下的多态结构和膜流动性影响转染效率。因此，他们将所有胆固醇替换为β-谷甾醇，他们的基于LNP的Prime编辑系统在免疫缺陷小鼠中实现了12.97%的PCSK9减少。然而，野生型小鼠中的效果有限。因此，值得针对Prime编辑系统专门优化LNPs，以实现期望的编辑效果。4.1.3 货物的化学修饰在上述讨论的三种基因编辑有效载荷形式中，mRNA是基因编辑的主要选择，因为其封装简便且编辑效率高。为了实现理想的编辑，mRNA和sgRNA需要进行化学修饰以增强其稳定性。已证明假尿嘧啶（Ψ）修饰可以增加mRNA的稳定性和翻译能力。Ψ修饰的mRNA在TT3 LNPs中使用，并实现了39.6%的PCSK9编辑。N(1)-甲基假尿嘧啶（m1Ψ）修饰的mRNAs也被广泛应用，这已经通过两种COVID-19疫苗得到验证。与Ψ相比，m1Ψ修饰的mRNA可以通过逃避TLR3激活来减少细胞内先天免疫原性，并通过增加RNA稳定性产生更多的蛋白质。因此，m1Ψ修饰的Cas9 mRNA和碱基编辑器mRNA是主要选择。5moU修饰也用于修饰Cas9 mRNA，已被证明可以增强基因表达，减少抗病毒反应，并改善基因编辑。除了mRNA外，sgRNA的化学修饰对于体内编辑效率也是必不可少的。研究人员探索的两种sgRNA修饰是2′ O-甲基核苷酸和硫代磷酸酯键的修饰。在一项研究中，除了与Cas9蛋白相互作用的约20个核苷酸外，所有核苷酸都通过2′ O-甲基核苷酸和硫代磷酸酯键进行化学修饰，从而在不影响环状结构和RNP形成的情况下增加其稳定性。当这种高度修饰的sgRNA与mRNA一起由cKK-E12 LNPs递送时，它实现了约100%的PCSK9减少和血清中35-40%的总胆固醇减少，突出了使用这种方法的高度修饰sgRNA的前景。Finn等研究了sgRNA的三种修饰水平，并发现高度修饰的sgRNA显示出强大的效率。他们对较少的碱基进行了修饰，并在由含有不饱和可电离脂质LP01的LNP-INT01递送时显示出强大的编辑效果。他们在3 mg/kg的RNA剂量下观察到血清TTR减少了97%，并持续了12个月，证明了体内基因编辑的持久性。总体而言，探索更多的修饰策略是至关重要的。4.1.4 临床试验LNPs比病毒载体具有多项优势，特别是在递送基因编辑有效载荷方面。因此，LNPs加速了基因编辑疗法向临床应用的推进。NTLA-2001是一种基于LNP的CRISPR/Cas9系统，旨在通过敲除TTR来治疗转甲状腺素淀粉样变性。在临床研究中，未观察到患者出现严重不良事件，最高TTR减少率为87%，剂量为0.3 mg/kg。然而，需要长期随访以检测任何潜在的非靶向效应。在一项II期试验中，所有接受0.3 mg/kg或更高剂量的患者观察到血清TTR中位数减少了91%，并选择了55 mg剂量以供即将到来的关键III期研究进一步评估。除了NTLA-2001外，NTLA-2002是另一种针对遗传性血管性水肿的靶向激肽释放酶B1（KLKB1）基因的基于LNP的基因编辑药物，平均减少了95%的每月血管性水肿发作频率。家族性高胆固醇血症是另一种遗传性疾病，通过VERVE-101进行治疗，这是一种基于LNP的碱基编辑疗法。在患者中测试了不同剂量的VERVE-101，0.45和0.6 mg/kg的两个剂量显示出更好的编辑效率，血清PCSK9水平分别减少了47%、59%和84%。尽管在这次临床试验中发生了四次轻微的输液相关反应和两次不良心血管事件，但重要的是要注意，这些不良反应并非专门与这种药物有关。计划于2025年进行一项随机II期试验。一些药物仍处于探索阶段，例如用于糖原贮积病1a的BEAM-301和用于α1-抗胰蛋白酶缺乏症的BEAM-302。基于LNP的基因编辑应用的安全性和有效性显著依赖于LNPs。因此，探索更高效和细胞特异性的LNPs是至关重要的。当临床使用LNPs时，需要考虑缺乏足够LDLR的患者，他们无法从传统LNPs中受益。应开发特定的LNPs以克服这一问题。为了满足这一需求，设计了N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）-LNPs，它们可以通过GalNAc而不是通过LDLR进入肝细胞，通过唾液酸糖蛋白受体途径。因此，GalNAc-LNPs可以将治疗性mRNA递送到缺乏足够LDLR的患者中。一项研究表明，最有效的GalNAc-LNPs含有36个PEG间隔单元和基于赖氨酸的支架，这比以前用于siRNA递送的TRIS支架更具柔性。与传统LNPs相比，优化的GalNAc-LNPs可以显著增加在LDLR缺乏的非人类灵长类动物中对Angptl3的编辑，从5%增加到61%。这种特定的LNP已应用于VERVE-102和VERVE-201。总体而言，这些数据表明LNPs可以安全有效地用于人类，并具有广泛的体内基因编辑潜力。4.2 肝脏以外的基因编辑4.2.1 肿瘤细胞通过开发基因组编辑工具，肿瘤治疗取得了重大进展，通过破坏相关基因来抑制肿瘤侵袭和转移，纠正癌基因以恢复正常功能，或激活细胞毒性T细胞以杀死肿瘤细胞。LNPs已被用于将CRISPR/Cas9系统递送到患有肝癌的小鼠中，以编辑在肿瘤细胞G2期高表达的Polo样激酶1（PLK1）。此外，该系统比其他核酸类方法（如siRNA）更有效，能够抑制肿瘤生长。Wang等成功使用SORT LNPs将靶向腿蛋白（LGMN）的CRISPR/Cas9系统递送到肺癌中，从而减少了与肿瘤细胞共注射时的植入和迁移。同样，Rosenblum等通过脑内注射编辑PLK1的CRISPR-LNPs，将胶质母细胞瘤小鼠的存活率提高了30%。为了促进LNP向弥散性肿瘤的递送，LNPs与靶向表皮生长因子受体的抗体缀合，使其能够被腹腔注射后选择性地摄取弥散性卵巢肿瘤。Anthyia等将Lyp-1缀合到LNPs上，以与胰腺癌细胞系中表达的神经纤维蛋白-1受体相互作用，从而实现肿瘤趋向性。他们共递送了siFAK和靶向PD-1的基因编辑系统。siFAK可以减少肿瘤力学和细胞外基质（ECM）的硬度，从而增加LNPs的内吞作用和组织穿透，进而促进更多基因编辑工具释放到细胞质中。因此，由于FAK敲低，肿瘤中基因编辑的效率提高了10倍以上。总体而言，通过LNPs递送的基因编辑工具有望抑制肿瘤生长，值得进一步研究。4.2.2 造血干细胞经过基因编辑的造血干细胞（HSCs）已显示出治疗各种贫血症的潜力。目前，正在探索使用基因编辑对HSCs进行工程改造的两种主要策略，以产生足够的血红蛋白：直接纠正镰状细胞贫血中血红蛋白β亚单位的点突变或沉默BCL11A转录因子以激活在成年期失活的胎儿血红蛋白。上述讨论了实现造血干细胞趋向性的LNP策略。Breda等使用CD117-LNPs介导的ABE系统，在10 pg/细胞的剂量下纠正了88%的点突变，且经LNP转染的HSCs仍能保持其分化特性。尽管电穿孔也可以将编辑系统递送到细胞中，但Vavassori等发现，与电穿孔转染的细胞相比，LNP转染的细胞活性和克隆性更强。因此，LNP可能更适合用于干细胞。Lian等最近开发了骨髓趋向性LNPs，通过引入额外的共价脂质种类，可以转染至少14种BM细胞。其中，BM趋向性LNPs已被用于将CRISPR/Cas系统递送到HBG1/HBG2基因启动子中破坏BCL11A转录因子结合位点，并在镰状细胞病Townes（HBBS/S）小鼠中编辑了5.2%的细胞，或递送ABE并纠正了HBBS/S小鼠中2.43%的点突变，证明了LNPs在体内直接编辑造血干细胞的潜力。4.2.3 肺部细胞基于LNP的肺部基因编辑备受关注。Li等筛选了可以雾化的新型LNPs。他们的LNPs比之前确定的两种雾化LNPs和双AAV系统表现出更大的效率。为了提高LNP的稳定性和其穿透肺粘膜的能力，Wei等通过使用他们的SORT LNPs来改变电荷，实现了肺部靶向，这是另一种肺部靶向方法。他们在2.5 mg/kg的RNA剂量下在肺部实现了15.1%的PTEN基因编辑。此外，SORT LNP已被用于编辑肺基底细胞，这对于肺上皮细胞的长期修复具有重要意义。此外，SORT LNP-HDR治疗在患者来源的人类支气管上皮细胞（HBE细胞）中，对于F508del CF跨膜传导调节因子（CFTR）突变的HDR校正效率保持在高水平，达到16%。最近，在可激活的tdTomato小鼠中，通过SORT LNP介导的CRISPR/Cas9编辑观察到在超过660天的时间内，超过70%的肺干细胞和超过80%的肺上皮细胞被编辑。此外，它介导的碱基编辑在CF小鼠中纠正了50%的肺干细胞。此外，Han等通过引入含有脒基的可降解脂质作为第五种成分，使用他们的肺部靶向LNP系统，在肺部实现了2.5%的TTR基因编辑效率，这高于SORT LNP。为了促进肺部的基因编辑，第一步是筛选肺部靶向LNPs。Xue等使用DNA条形码方法进行体内高通量筛选LNPs。LNP-CAD9脂质在肿瘤模型中显示出对血管内皮生长因子（VEGF）的优越编辑效率，与SORT-LNPs相比。与此同时，Haley等发现，对于与DOTAP相关的LNPs，高通量b-DNA筛选并不可靠，因为单个LNP剂量低（77 ng ssDNA/小鼠）可能没有引发显著的凝血反应，阻止了高通量筛选准确反映DOTAP的肺部靶向特性。尽管如此，他们的研究确定了一种高效的肺部编辑A14 LNP，在TTR编辑模型中没有肝脏编辑。此外，这种LNP能够编辑肺部的内皮细胞和上皮细胞，在单剂量后实现高达20%的indels。4.2.4 肌肉细胞LNPs对肌肉细胞的趋向性使得在这些细胞中应用基因编辑更加安全有效。具有特殊结构的可电离脂质的LNPs可以通过肌肉内注射靶向肌肉细胞。Kenjo等发现，使用TCL053 LNP递送的CRISPR/Cas9系统可以在肌肉中持续发挥编辑功能，时间超过1年。此外，即使在多次注射后，该平台也显示出持续的效力，而病毒载体的递送在第二次注射后没有显示出任何可观测的效果。TCL053 LNP-CRISPR系统也在约10%的突变外显子皮肤中被观察到，并恢复了肌营养不良蛋白的表达。相比之下，Zhu等使用RNP/ssODN修复突变的肌营养不良蛋白。为了递送RNP，他们设计了GD-LNPs，这些LNPs由对RNP具有强亲和力的胍基团和用于快速释放RNP的二硫键组成。GD-LNPs在LNP注射的肌肉的基因组DNA靶向区域产生了3.5%的indels和0.77%的HDR效率。4.2.5 其他细胞除了上述提到的HBV外，基因编辑工具对于消除CD4+ T细胞中的HIV也具有价值。研究表明，以质粒形式使用的LNPs可以从T细胞中耗尽HIV，尽管与RNP或mRNA相比，这些构建体相对较为复杂，且在临床转化方面不太可行。对于皮肤基因编辑，皮肤的屏障特性限制了LNPs的原位注射。Bolsoni等表明，微针和剥脱激光可以实现5%的皮肤碱基编辑，用于常染色体隐性先天性鱼鳞病患者细胞。LNPs也可以用于角膜基因编辑。研究人员在tdTomato小鼠的角膜基质和内皮细胞中实现了6.2 ± 2.9%的编辑。Herrera-Barrera等使用寡聚肽赋予LNPs穿透神经视网膜的能力。最近，Hołubowicz等发现，经过优化的SM-102 LNP可以理想地封装ABE或PE RNP。他们观察到，通过视网膜注射LNP-RNP复合物，平均有0.30%的视网膜色素上皮特异性65 kDa蛋白（Rpe65）基因组DNA通过ABE得到精确校正，平均有0.12%通过PE得到精确校正，并且挽救了两者的暗适应闪光视网膜电图（ERG）a波和b波。因此，他们强调，添加2.5%的DMG-PEG 2000增强了RNP的封装，并提高了体外和体内的递送效率。为了实现更好的封装和递送RNP，可电离脂质的pKa值应高于6，但其毒性也是一个问题。其中，2.5%的DMG-PEG 2000显示出更好的RNP封装和体外及体内递送效率。总体而言，LNP−CRISPR疗法将在不久的将来扩展到多种治疗疾病中。结论基因编辑工具的快速发展推动了生命科学的重大进步，特别是在治疗遗传性疾病方面。为了增强其应用，基因编辑工具应能够在不产生DSB的情况下纠正基因组中的大段序列，并有效解决特定基因中的各种突变类型，以实现多功能性。这些改进将提高基因编辑的精确性和安全性，为其更广泛的临床应用铺平道路。然而，所有基因组编辑工具都面临着一个共同的问题，即体内递送。它们需要载体来封装所有必要的成分，并安全高效地将它们递送到感兴趣的细胞或器官中。因此，开发可靠的递送平台对于加速基于CRISPR的基因编辑的临床实施至关重要。LNPs是一种非病毒载体，能够封装各种基因编辑形式，并克服体内递送的生物屏障。通过静脉注射给药的LNPs被肝脏有效摄取，为肝脏基因编辑提供了机会。然而，肝外基因编辑仍然是一个挑战。了解非肝脏LNP配方背后的机制对于合理设计具有期望靶向能力的下一代LNPs至关重要。此外，总结在先前研究中可电离脂质的构效关系（SAR）可以帮助设计可电离脂质，并在下一代LNPs的开发中发挥建设性作用。使用DNA或mRNA条形码技术进行体内筛选可以进一步加速细胞/组织趋向性LNPs的鉴定。虽然质粒、mRNA和蛋白质都可以由LNPs递送用于基因编辑目的，但由于其与LNPs的良好相容性，mRNA更为有利。最后，对于临床基因编辑应用的LNPs验证需要更好的临床前模型（例如人源化小鼠模型和非人类灵长类动物），以更直接地从动物转化为人类。CRISPR/Cas9系统作为当前最热门的基因编辑工具之一，在临床上具有广阔的应用。结合LNP递送，这一技术展现出实现精准基因矫正和治疗的巨大潜力。派真mRNA-LNP一站式服务平台，可提供从基因合成、质粒线性化、mRNA体外转录到LNP包封整体解决方案，全面支持您的基因编辑研究。我们还提供多种CRISPR现货mRNA产品，欢迎后台留言了解详情。关于派真生物