Edrecolomab

Centocor位于宾夕法尼亚州的Malvern市，成立于1979年，创始人是电气工程师Michael Wall和病毒与免疫学家Hilary Koprowski。虽然Centocor早在1999年就与强生合并，但是提及biotech的发展史，它却是不可缺失的元素。Centocor不仅是单抗药物的先驱，还为初创型biotech公司开创了全新的发展模式。Centocor与众不同的地方是巧妙地利用科学技术带来的商业机会，并通过“借鸡生蛋”的方式建立起了产品管线，让公司以最快的速度实现了盈利。 一、Centocor的诞生 1973年，基因工程技术问世，这项诺奖级的技术催生出一类全新的公司——生物技术（biotech）公司。基因泰克公司（Genentech）被视为biotech的开端，该公司成立于1976年，旨在利用基因重组技术开发和商业化创新药。然而在基因工程技术问世之后的两年里，又出现了另一项诺奖级的生物技术——杂交瘤技术，而Centocor就是最早开发该技术的公司之一。 Michael Wall是一位毕业于麻省理工学院的电气工程师，早年在电气行业工作。上世纪60年代中期，Wall从电气行业转行到了生物行业，成立了Flow Laboratories。1969年，Wall将该公司卖给了General Research Corp，但Wall继续为General Research运营了10年。在此期间，Flow主要生产和销售细胞发酵相关的产品，这使Wall对生物技术行业产生了浓厚的兴趣。Centocor的另一位创始人Hilary Koprowski是Wistar研究所的所长，著名的病毒与免疫学家。Koprowski是最早研究单克隆抗体（单抗）的科学家之一，于1978年获得了两项制造单抗的重要专利。他本想将那两项专利授权给勃林格殷格翰（BI），但经过大半年的拉锯谈判，BI并没有买下专利权益。这让Koprowski很恼火，于是才有了自己组建公司的想法。最终，Koprowski决定与Wall合作，于1979年5月在费城组建了Centocor。 基于实验室长期的研究，Koprowski坚信Centocor很快就能开发出诊断性的单克隆抗体。Centocor之所以选择开发诊断类产品，是因为诊断性产品的开发难度和开发周期远小于治疗性产品。尽管如此，治疗性产品也被纳入了公司的远期发展规划。在公司成立后不久，Ted Allen和Hubert Schoemaker先后加入了公司，他们的到来为毫无市场开发经验和产品设计经验的Centocor起到了至关重要的作用。 二、借鸡生蛋 与众多初创型biotech公司一样，缺钱是永远无法回避的话题。在公司成立之初，Wall利用他的个人影响力到处找投资。1979-1981年间，Centocor通过私募股票筹集了约700万美元，但这点钱对一个公司而言简直是杯水车薪，Centocor如想存活与发展，必须快速产生收益，而合作是该公司成功的秘诀。 虽然当今的初创型biotech都会努力地建立合作，但在70年代并不是这样。当时的biotech几乎都是风险投资资助下的内部研究——从候选分子发现、产品开发到上市后的生命周期管理都是在自己的实验室完成，而Centocor是最早打破这种“in - house”研发模式的biotech。在长达20年的时间里，Centocor一共推出了10个产品，而这些产品全部来自于授权引进。就如Schoemaker后来回忆的那样，从外部引进项目比自己从头开发要便宜的多。因为广泛的合作， Centocor在1984年实现了微盈利，而与Centocor同一时期成立的基因泰克、安进、Biogen却还在为“年底的揭不开锅”而发愁。 由于Koprowski的关系，Wistar研究所成为Centocor的首个合作伙伴。1979年，Centocor与该研究所签署了三项许可协议，以2.5万美元的首付款外加4%~6%的衍生产品销售额提成为代价，获得了4项专利。为了便于合作，Centocor还与Wistar建立了开创性的联盟机制，这极大地增加了合作的灵活性。1980年，《Bayh - Dole法案》获得通过，该法案为美国政府资助的学术成果转化提供了指导，非常有利于科研合作的达成。随后的几年里，Centocor又与Scripps临床和研究基金会、麻省总医院等知名科研机构达成合作，“廉价”地引进了大量的项目。到1990年时，与Centocor建立合作的研究机构数量达到了80多个。 除了产品开发方面的合作，Centocor也试图通过建立销售端的合作，以节省市场开发成本和渠道建设成本。当时的诊断市场规模约为20亿美元，产品均以化学合成的小分子为基础，竞争较为激烈，而且主要的市场份额被雅培、罗氏、华纳-兰伯特等巨头控制。这些巨头都基于自己的专有诊断设备开发了独立的检测和结果分析体系，测试试剂、分析方法互不兼容。因此，Centocor开发的以单抗为基础的诊断方法，不仅不会被视为竞争对手，还可能成为争相拉拢的合作对象——有助于他们推出新产品打破市场格局。为了建立合作，Centocor在产品设计时就做到了与巨头们的诊断系统兼容。1981年，雅培成为了该公司的首个合作伙伴。次年，Centocor的首个产品获批上市。随着获批产品的不断增加，Centocor广泛与诊断公司建立了合作，不仅授权他们销售和使用试剂盒，还允许他们基于Centocor生产的抗体二次开发产品。 正如当初商业规划的那样，Centocor很快就迎来了自己的产品。1982年，FDA批准了Centocor的狂犬病诊断试剂，这使得该公司成功IPO。1983 -1986年间，Centocor又成功推出了一款乙肝诊断产品和四款癌症相关的诊断产品。由于当时美国和诸多发达国家都要求在输血前进行乙肝筛查，这使得Centocor的乙肝检测试剂盒成为了爆品。另外，四款癌症诊断产品的表现同样不俗，到1990年，Centocor已经占领了全球四分之一以上的癌症抗体检测市场。 三、造影剂的沉浮 1982年，Centocor推出了首个产品，这使得该公司成功IPO，募集到资金约2100万美元。1983年，Centocor又推出了两款诊断产品，由于销售表现不错，在1984年实现了微盈利。随着获批产品的不断增加，Centocor的营收从1985年的2000万美元迅速增长至1989年的7200万美元。 然而进入壁垒越低的赛道越容易发生内卷，随着技术的不断成熟，越来越多的企业进入了赛道，他们基于市售的抗体很快就能开发出诊断产品，到1983年时，美国已有上百家企业布局了抗体诊断技术，仅获批上市的产品就有20多个，处于研发阶段的产品更是数不胜数。为此，Centocor不得不考虑开辟新赛道。1985年，Centocor新开设了造影剂部门，并开始研发三种针对癌症和心血管系统疾病的造影剂。当时的分析师认为单抗造影剂市场将快速发展，仅癌症和心血管系统疾病的潜在市场将在1988年达到三到四亿美元。1986年，Centocor再次进行了公开募股，为了获得投资者的认可，Centocor对外宣称很快就能推出造影剂产品。1989年8月，Centocor用于心血管系统疾病诊断的造影剂Myoscint在欧洲获批上市，趁此机会，该公司又一次公开募股。 虽然Centocor向投资者兑现了“很快推出产品”的承诺，但销售表现远不及预期。早在1987年，就有金融分析师预测Centocor的心血管造影剂的年销售额有望达到3-4亿美元，但在此后的20年里，全球单抗类造影剂的市场规模一直也没能超过1亿美元。虽然单抗的确是很好的靶向造影工具，但体内代谢时间过长，这大幅延缓了影像读取和诊断结果的获得时间，不仅如此，当时市面上已有对患者伤害更小、结果更精准的诊断产品，这意味着Myoscint刚上市就被淘汰了。不过该产品也并非一无是处，Myoscint可以很好地识别心脏移植后的排斥反应和心肌炎，后来被超适应症用于心脏移植后排斥反应的监测。 尽管Myoscint在欧洲的销售表现不佳，但Centocor仍不肯放弃，努力挣扎着将Myoscint推向美国和日本市场。由于申报资料的问题，Myoscint屡次被撤回，直到1996年才最终获得FDA批准。同年，日本也批准了该产品。不过这些似乎都是无畏的挣扎，该产品还是因为销售不理想而在1999年退市。 三、冒险之旅 尽管70年代末期已经诞生了多家biotech，但大多都是利用基因工程技术合成人体激素，如胰岛素、生长激素、代谢酶等，这些药物的安全有效性都是已知的，主要解决的是发酵工艺的问题，而单抗是此前人类从未接触过的一类物质，大部分人并不知晓它们的潜在用途，况且以当时的技术做出来的鼠源单抗有非常强的免疫原性，疗效差而不良反应大，离商业化非常遥远。然而Centocor作为能最早生产单抗的公司，单抗治疗也被纳入到长期战略，为了解决当时单抗存在的问题，Centocor很早就布局的单抗的人源化研究。 说实在的，在当时的人们看来，这是一种纯粹的冒险，不过世界上从来不缺探险者，Centocor很快就找到了战略合作伙伴。1980年，FMC corporation同意出资1240万美元与Centocor成立合资公司（JV），以研究单克隆抗体的人源化。经过几年的努力，研究取得了巨大的进展，而且做出了候选分子。然而在初见苗头之时，Centocor放弃了合作。1986年，Centocor用137万股买断了JV公司人源化抗体的独家权益，又从加州大学引进了另一种人源化抗体HA-1A（ebacumab）。到1988年，Centocor的研究团队开发出了30多个单抗分子，并计划提交12个分子的临床试验申请（IND）。 Ebacumab是一种针对革兰阴性菌所致败血症的药物，当时的美国，每年有10万人死于这种疾病，如果开发成功，有望成为一款年销售额达10-15亿美元的产品，而Centocor也有望因此一步登天——成为一家大型制药公司。小规模的临床试验初步证明了该产品的安全有效性，让Wall和Schoemaker雄心勃勃，他们认为诊断业务产生的利润和技术合作收入能够推动Centocor在2000年前后发展成默沙东一样的制药巨头——默沙东是当时的全球第一大制药公司。一开始，他们还坚持通过JV的形式打造这项业务，但在某华尔街咨询顾问的“煽动”下，让他们产生了肥水不流外人田的想法。为了独自开发产品，Centocor在1986-1992年间进行了9次股权或债务融资，筹集资金达5亿美元。而这些钱几乎都用在了临床试验、荷兰工厂建设和销售队伍建设上。 1991年2月，《新英格兰医学杂志》发表了ebacumab的三期临床试验结果——ebacumab治疗组的败血症患者数量比对照组减少了39%，死亡率下降了47%。随后不久，欧洲率先批准了该药物。同年9月，FDA疫苗和相关生物制品顾问委员会也建议批准该产品上市，而Centocor也做好了上市前的准备。然而人红是非多，在ebacumab即将上市之际，Centocor被竞争对手Xoma Corporation起诉专利侵权——Xoma从加州大学的另一分校区引进了一款相同靶点的单抗（edobacomab），但这是一款鼠源单抗，在Xoma和辉瑞的共同推进下，edobacomab已领先ebacumab几个月提交了上市申请。为了抵抗ebacumab的竞争，Xoma联合辉瑞向Centocor发起了专利战。一开始，Schoemaker想通过和解的方式解决问题，但当时的业务总裁兼首席运营官James Wavle认为和解会导致交叉授权，进而引起收益减少。最终，因为贪婪，ebacumab功亏一篑——Centocor不但没能赢下官司，还被迫公开了有关ebacumab试验设计和结果分析的信息，而这些信息正好又为竞争对手的“吹毛求疵”提供了依据。 专利战引起了轩然大波，并招来越来越多的质疑。美国独立卫生院（NIH）的科学家发现ebacumab在动物试验中不但无法预防败血症，而且还有致命风险。几乎在同一时期，该产品也引起了欧洲医生的质疑。一是药物定价过高，二是没有显著的临床获益。随着质疑声的不断增多，FDA也引起了重视，但这种情况下，Centocor还试图通过向FDA施加压力以尽快获得药物的批准。最终，Centocor在1992年4月迎来了坏消息，FDA以“需要更多临床数据”为由，拒绝批准ebacumab (Centoxin)。 四、艰难的翻身之战 1990年，ebacumab的临床开发接近尾声，而Centocor也为这款具有重磅炸弹潜质的新药做足了上市前的准备。一方面，该公司在欧洲建设了工厂，以满足欧洲市场的正常供货，另一方面，该公司还招募了大量的市场和营销人员，以快速形成推广和铺货能力。因为这些能力的建设，公司的员工总数从几百人暴增至1500人。因为ebacumab的失败，这些资源再无用武之地，反而成为沉重的财务负担。为了及时止损，Wall在ebacumab被拒绝批准之后，迅速推动了公司重组。前前后后裁掉了三分之二的员工，Hubert Schoemaker接任了董事长，David Holveck接任了CEO。Wall离开了董事会，公司从此失去了创始人的元素。 虽然遭遇了巨大挫折，但Centocor还没到穷途末路的地步。一方面FDA拒绝批准ebacumab的原因是临床证据不足，这也就是说该产品还有挽救的希望，另一方面，该公司管线里还有多个药物，而且ReoPro（阿西单抗）已经进入到三期临床试验。一切都要大量的资金，然而彼时的Centocor已在ebacumab上烧了数亿美元，而且股价因该产品的失败而暴跌，Wall和Schoemaker收到了大量的投资者诉讼。为了起死回生，Centocor只能想其他办法融资。 在Centocor的危急关头，礼来成了雪中送炭者。在ebacumab被FDA拒绝后不久，礼来与该公司达成了战略合作。礼来用5000万美元现金收购了Centocor 5%的股份，并同意另支付5000万美元用于继续开发ebacumab，如果ebacumab开发失败，则继续支付2500万美元用于支持阿西单抗的开发，而作为回报，礼来将获得阿西单抗和ebacumab的销售权益。在礼来的资金支持下，1992年7月，Centocor又对ebacumab开展了一项三期临床试验，但因为设计方面的缺陷，该试验在1993年宣告失败。同年，ebacumab在欧洲停止销售，Centocor步入了至暗的时刻，财务报表上也出现了资不抵债，净资产为-1919万美元。 1993年，ebacumab宣告彻底失败，原本预想的重磅炸弹，仅在1992年销售了一个完整财年，销售额也仅为1255万美元。Ebacumab的失败对Schoemaker等人造成了巨大的打击。不过俗话说，永远不要把全部的鸡蛋放在同一个篮子里，因为Centocor还有其他药物。在礼来的帮助下，阿西单抗于1994年同时获得了欧盟和美国的批准，Centocor的股价也因此而快速反弹。随着阿西单抗销售额的快速增长，Centocor在1997年再次实现了盈利，净利润为1113万美元。 除了礼来，Centocor还与先灵葆雅、史克必成等企业建立了合作，到1998年底，Centocor已经拥有4大上市的治疗药物——ReoPro（阿西单抗）、Retavase（瑞替普酶）、Panorex（edrecolomab）和Remicade（英夫利昔单抗），年销售额达到了3.17亿美元，此外还有多个项目处于不同的临床试验开发阶段。为了发展治疗药物，Centocor将诊断业务单独拆分，并逐渐剥离，成为一家纯粹的制药公司。 五、Centocor带来的启示 在形势一片大好之际，Centocor却仅以49亿美元的价格卖给了强生，不得不让人惋惜，但导致这种结果的原因是多重的。第一，Centocor与多家公司有专利纠纷，而这些纠纷几乎都是在项目授权时就埋下了“祸根”；第二，跨世纪期间，制药行业非常“动荡”，像Centocor那样既有产品、又有技术，而且非常具成长潜力的公司绝对是制药巨头争相追逐的对象，与其被强行兼并，不如主动找“靠山”，至少还能保持独立运营；第三，或许是屡次挫折让Schoemaker等人的雄心不再，他们认为Centocor没有足够的资金持续支持烧钱的研发，也没有足够的产能和销售能力将产品的市场价值最大化；第四，董事会已经没有创始人元素，是一个纯市场化的公司，创业时的那份“情怀”早已不再；第五，Schoemaker低估了英夫利昔单抗的发展潜力；第六，“收购”其实是合并，1999年底，强生通过用4500万股交换Centocor的7100万股完成合并，而Centocor以子公司的身份独立运营。后来，强生安排Centocor与另一家子公司Ortho Biotech合并为Centocor Ortho，而该公司是强生制药业务快速增长的主要驱动力。 虽然因为被强生收购而消失在历史的长河，但Centocor在biotech的发展史上始终是不可磨灭的一笔。Centocor的成长之路为后人留下了以下几点启示： 启示一：商业机会的识别与定位。Centocor是最早布局单抗的公司之一，被后人称为单抗领域的先驱，但该公司并没有一开始就布局单抗治疗，而是选择了诊断。由于诊断产品研发更简单、更容易获得批准，这让该公司实现了快速盈利。 启示二：开创性地打破了in - house的研发模式。Centocor商业模式是从外部拿项目，用很低的成本就从各科研机构授权到大量的候选药物，这使得该公司的研发费用较低，烧钱速度与程度远不及基因泰克、安进等biotech公司。 启示三：Centocor成功的一大秘诀是一有机会就募股，而不是在缺钱的情况下才融资。在公司的高光时刻，往往只需要稀释很少的股份就能筹集到大量的资金，而这些钱可以用于扩大产品管线或企业规模，以换取更多的净现值。 启示四：处理好与利益相关者的关系。Centocor之所以多次遭受危机，一是没处理好与竞争对手的关系，导致了Xoma的专利诉讼，而该诉讼是ebacumab “翻船”的导火索；二是没有处理好客户的关系，因定价过高而导致了医生的质疑和支付部门的抵制，而这些是推动ebacumab遭遇滑铁卢的关键原因；三是没处理好与FDA的关系，使得药物迟迟不被批准，除了ebacumab，Myoscint也经历了相似的问题。 参考文献略 相关阅读——另一家Michael Wall创办的著名公司：制剂创新巨头Alkermes的发家故事：万里长城不是一朝一夕建立起来的 本文节选自新版《跨国药企成功启示录》，任何媒体、公众号、网站转载本文都会被起诉侵权。作者：魏利军，北京药眼信息咨询有限公司创始人，著有《跨国药企成功启示录》、《仿制药企兴衰启示录》和《制药企业的战略与产品管线》，从事产品线规划、产品立项和战略策划相关的工作十余年，担任过多个企业的产品战略顾问。如对本文有建议或发行内容有错误，请不吝赐教，作者微信Voyager88

摘要：通过使用杆状病毒表达载体系统 (BEVS)，在昆虫细胞中生产重组蛋白成为趋势。尽管许多蛋白质通过该平台成功表达，但由于细胞病变效应、共感染和共表达的不可预测性以及杆状病毒基因组不稳定性等问题，一些蛋白仍然无法成功表达。为了在昆虫细胞中表达不同的蛋白质，已经对许多启动子进行了研究，但在调查市售杆状病毒载体时，发现新启动子的使用仍然匮乏。在推进该平台生产更多种类的蛋白质和复合物的过程中，此类新载体的开发是不可避免的。深刻地认识病毒基因表达调控和启动子（如病毒本身的、合成的和昆虫来源的启动子）的选择原理，将有利于研究人员合理协调并利用这些复杂的基因调控机制来增加BEVS异源基因表达的成功率。在这里，我们总结了一些可用于改善昆虫细胞中重组蛋白和多蛋白复合物表达的研究进展。1 前言杆状病毒表达载体系统(BEVS)被用作生产重组蛋白的工具已经有40多年的历史了。最早由德克萨斯大学的一个小组证明了它的用途，它被用于产生人β干扰素。这项工作是最早的相关研究论文，他们展示了该系统在生产具有生物活性重组蛋白方面的巨大潜力。从那时起，众多研究人员对该系统进行了重大改进，现在已被用作一个通用的蛋白表达平台。来自BEVS的蛋白质已用于生化、生物物理和结构生物学研究，并继续用于药物开发和癌症研究。由于其高度特异性的宿主范围，重组杆状病毒也被用作杀虫剂的安全绿色的替代品，并且最近已成为人类疫苗生产的重要工具。即使多年来该系统的多样性得以发展，但基本设计仍然保持不变。产生重组杆状病毒，选择的外源基因置于天然启动子的控制下，然后在感染周期中表达，在细胞裂解过程中释放蛋白质。为了达到最大表达水平，大多数利用极晚的启动子来驱动外源基因的表达。虽然当需要大量重组蛋白时，这种方法通常是成功的，但在某些情况下，使用表达较早或较弱的替代启动子可能有利于最终蛋白质的质量和产量。在快速表达过程中发生聚集的蛋白质和需要高级翻译后修饰的蛋白质也被证明可以使用早期启动子的持续稳定表达中获得理想的产物。此外，当共表达蛋白质时，使用多个强的极晚期启动子会给细胞带来负担，并导致蛋白质产量不佳。由于这些原因，使用替代启动子可能有利于外源基因表达产物的精细调控和最优表达。杆状病毒基因的表达调控主要是通过使用各种启动子、基序、转录因子和一种新型病毒编码的RNA聚合酶在转录水平上调节。根据生产过程特性的需求对载体进行更大程度的定制化将有助于研究人员充分利用BEVS的潜力。在这篇综述中，我们将讨论商业化的强启动子和晚期表达启动子之外的选择，这些选择可以利用整个杆状病毒感染周期来优化蛋白质生产（见图1）。2 草地贪夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)AcMNPV是一种感染鳞翅目昆虫的高致病性杆状病毒，是昆虫细胞中重组蛋白生产最常用的杆状病毒。它的基因组由编码超过150个基因的双链DNA组成。杆状病毒的感染过程具有时序性，可分为立即早期、早期、晚期和极晚期。这些节点是由被转录的基因和感染后它们被表达的小时数来定义的。立即早期基因是第一个被表达的病毒基因。研究发现mRNA转录产物最早在感染后30分钟就可以检测到了，并持续长达6小时，尽管有一些必需基因的启动子在感染周期的后期仍然活跃。立即早期基因产物主要是早期基因转录所必需的转录激活剂。立即早期和早期基因都在病毒DNA复制之前开始转录，并利用宿主RNA聚合酶II。病毒DNA复制的开始表示向晚期基因表达的转变。这种转变通常发生在感染后6小时，随后产生出芽的病毒粒子。时程转录研究表明，随着DNA复制，晚期mRNA转录物在细胞内迅速增加，而宿主mRNA则稳定下降。晚期基因由新型杆状病毒RNA聚合酶转录，其表达依赖于病毒DNA复制。许多晚期基因是结构基因,时感染后12-18小时产生的芽生型病毒粒子 (budded viruses, BV) 和包埋型病毒粒子 (Occlusion derived virus, ODV) 所必需的基因。从大约感染后18小时开始并持续到细胞裂解是极晚期的阶段。这是感染的最后阶段，与包埋型病毒粒子的形成和包括多角体蛋白在内的几个基因的过度表达有关。极晚期的基因经历了快速的转录爆发，导致它们的基因产物在细胞中大量积累，而此时几乎所有宿主基因的表达都减少了，从而可以将细胞资源用于快速产生病毒后代。由于这种高活性，多角体启动子被认为是杆状病毒表达系统的标准启动子。3. 立即早期和早期启动子立即早期和早期启动子在病毒DNA复制之前被激活。立即早期启动子由宿主细胞RNA聚合酶II转录，也利用宿主的转录因子。立即早期和早期启动子的结构组织与晚期和极晚期杆状病毒启动子有很大不同，而是更类似于其他真核启动子的结构。杆状病毒立即早期启动子最显着的特征是保守的CAGT基序，其作为转录起始位点并在调节下游基因表达中起重要作用。在某些情况下，立即早期启动子包含一个TATA样基序和/或一个起始序列。该区域被宿主RNA聚合酶II识别，并允许在感染后马上转录立即早期病毒基因。为了确定CAGT基序的功能，Pullen等人，在杆状病毒IE-1启动子的这个序列中引入了该位点的特异性突变。结果发现，CAGT基序序列的改变降低了mRNA的水平并降低了整体启动子的表达效率。虽然一些早期启动子包含CAGT基序，但许多不包含，但它们通常需要立即早期基因进行反式激活。IE1启动子是一种立即早期启动子，是最常用于杆状病毒表达的组成型启动子，因为它在所有时间阶段以及未感染的昆虫细胞中都具有活性。 因此，它经常用于瞬时表达质粒；IE0/IEI和IE2的启动子也以这种方式使用。39k启动子是一种早期启动子，它被IE1蛋白反式激活。当与IE1 蛋白共表达时，39k启动子也可以暂时使用。已证明IE1和39k启动子对分泌蛋白的生产特别有用。4.晚期启动子晚期启动子由识别保守的(A/G/T)TAAG晚期/极晚期启动子基序的病毒RNA 聚合酶转录。转录起始于该基序内的第二个核苷酸，并且它的存在是启动子活性必需的。调查晚期启动子中TAAG基序功能的研究表明，该序列中的突变破坏了转录。热力学稳定性，而不是其周围核苷酸的序列特异性，决定了它作为晚期启动子的功能，这表明链分离的容易性和病毒聚合酶的进入有助于转录调节。杆状病毒利用由四个亚基（LEF-8、LEF-4、LEF-9 和 p47）组成的新型α鹅膏菌素抗性RNA聚合酶，它在引导细胞资源用于子代病毒生产方面发挥重要作用。编码聚合酶亚基的基因在感染过程的早期利用宿主机器进行转录。当杆状病毒聚合酶组装并且DNA复制接近完成时，晚期和极晚期病毒基因的转录便可以开始。这是通过病毒RNA聚合酶识别TAAG基序来实现的，这可以使病毒基因能够独立于宿主转录机制进行表达，从而防止与宿主基因的竞争。在对一些晚期表达因子进行更深入的研究后发现，有几个因子对于质粒复制或刺激质粒复制是必不可少的，这表明杆状病毒晚期基因转录可能与宿主DNA复制同时发生的，而不是在复制完成之后。由于CAGT和TAAG元件的存在，不论是在早期还是晚期阶段，gp64启动子均可以被IE1反式激活，表现出活性。在BEVS中，gp64启动子经常与gp64融合的异源蛋白连接用于病毒蛋白的展示。更常用的是晚期启动子，包括p6.9和pCap。核衣壳中与病毒DNAs相关的富含精氨酸的6.9kDa基础蛋白vp39是由pCap启动子驱动表达。通常这些非常晚期的启动子表达的蛋白均表现出功能失调或者聚集。早期的启动子表达的重组蛋白通常表现出更好的质量，启动子pCap在hr3增强子存在时，由于hr3增强子长时间调节表达蛋白收获量与晚期启动子表达量相似。据推测，可能杆状病毒感染期间宿主细胞健康状况的下降从而导致蛋白质量控制不佳和蛋白质聚集；尚不清楚为什么某些重组蛋白会出现这种情况，而并非所有蛋白都是如此。5 非常晚期启动子非常晚期的启动子活性在感染后18-24 小时达到峰值，并超过晚期启动子活性。在感染后24h时，非常晚期启动子在细胞中的转录水平超过其他所有的启动子。由于非常晚期启动子含有TAAG元件和转录起始位点，所以非常晚期启动子也可以被杆状病毒RNA聚合酶所识别。多面体蛋白和p10基因的TAAG转录起始位点和ATG启动子之间的富含的AT区域被认为是突发序列，进一步区分了这些非常晚期基因启动子区域。尽管这2个启动子序列有差异，但是他们的存在对于晚期基因的爆发表达是非常重要的。突发序列的突变将导致基因表达量降低10-20倍。非常晚期转录调节因子Vlf-1就是结合在突发序列上促进下游基因的过表达。在天然病毒感染的细胞中，多角体蛋白在ODVs周围形成结晶体基质保护蛋白免受细胞环境失活的影响，使ODVs在病毒感染结束时积累高达50%细胞蛋白总量。然而在实验室培养的昆虫细胞研究人员首选使用BEVS来进行外源基因的替换，而不是必须使用病毒感染。在感染周期中多角体蛋白启动子在非常晚期时很活跃，而且在大约感染后18小时时会有一个爆发性的转录活性。Possee和Howard首次界定多角体蛋白基因ATG上游的69bp为多角体蛋白启动子，后来Rankin也鉴定出这个区域是多角体蛋白基因表达所必须的。Morris和Miller证实了经过多角体蛋白启动子表达的报告基因分别比晚期启动子高2-3倍和比早期启动子高10-20倍。多角体蛋白启动子介导的外源基因蛋白表达常常会有显著的蛋白产物累积，由于多角体蛋白启动子非常晚期的表达活性，释放的病毒蛋白酶使宿主细胞产生显著的细胞病理学特征，会导致其使用受到限制，这些以及其他许多推测的不确定因素产生的效应可能使得产生蛋白包涵体，蛋白错误折叠或者分泌效率低下，从而使蛋白质量较差。P10蛋白在感染周期的非常晚期高水平表达，被认为在病毒释放所需的包涵体成熟和细胞裂解中发挥作用。Weyer和Possee首次将p10基因ATG上游101个核苷酸定义为p10启动子序列，并建议将其用于外源蛋白的表达。从那时起，p10启动子被广泛应用于BEVS中生产蛋白质，比如花椰菜花叶病毒基因1和人白介素2的生产。P10也可以用来连接其他启动子用于共表达，比如Furuta用来生产6D9抗体的Fab片段，Song用来生产抗结直肠癌单克隆抗体CO17-1A。与多角蛋白启动子相比，p10启动子激活要早几个小时，转录水平要稍微低于多角蛋白启动子。6 非常晚期启动子杂合体杂合启动子构建涉及全启动子区域的配对来增加表达的持续时间。P10启动子和各种启动子可以成功配对，当与IE1共表达时，p10-p6.9(TB3）的杂合启动子表达的GFP水平最高，比多角体蛋白启动子表达的GFP高4.5倍。当Vp39启动子pCap和多角体蛋白启动子配对时在晚期阶段可获得更高水平的蛋白表达，而多角体蛋白启动子在感染后6小时时就可以检测出转录产物，直到非常晚期才开始过表达。当CMVmin启动子和多角蛋白pu区域(ORF4、ORF5和lef2）基因上游序列再加上一个hr时，不需要Tet反式激活元件的刺激就有活性。pu区域中的这3个基因任何一个基因的突变或者删除，CMVmin启动子都会丧失类似的高表达能力。ORF4和ORF5的特性还不确定，但是lef2在转录和质粒复制中发挥作用。通过在多角蛋白启动子尾部增加一定数量的(1-16）突发序列加上ie-2启动子vlf-1过表达区域合成出一些新的多角蛋白启动子。在High Five细胞中，增加2-5个突发序列靶蛋白有更高的表达量，其中增加2个突发序列的启动子与多角蛋白原始启动子相比具有最高的表达性能。其他杆状病毒或者生物启动子也被用来增加AcMNPV的非常晚期的表达。经过转录组分析，Spodoptera exigua杆状病毒orf46启动子SeMNPV具有高转录活性。orf46启动子在AcMNPV中表现出高水平的晚期表达，但当置于多角体启动子下游时，eGFP的表达增加了2倍。将龙虾原肌球蛋白cDNA的前导序列L21置于多角体蛋白启动子的下游，荧光素酶的表达比单独的多角体蛋白启动子高了7倍。7 增强子增强子是富含AT重复或者回文结构的同源区域，此区域经常会出现EcoRI酶切位点[55]。为杆状病毒启动子添加增强子可以大大提高蛋白产量。AcMNPV基因组包含9个增强子同源区域(hr1，hr1a，hr2，hr2a，hr3，hr4a，hr4b，hr4c和hr5）序列。hrs除了作为增强子还具有复制起始的功能。当放置在果蝇hsp70启动子下游时，hr1作为38kDa的hr1-BP蛋白结合位点来增加异源基因的表达。当增强子置于荧光素酶报告基因下游时，多角体蛋白启动子表达也提高了11倍。在Sf9细胞中Hr2增强子与rAAV启动子RBE联用来提高基因表达。在家蚕幼虫中IE1启动子和BmNPV hr3增强子联用可以获得高蛋白产量，当hr3和晚期启动子vp39联用时除了获得更高的蛋白产量还降低了蛋白聚集。当39K启动子添加了hr5增强子，IE1基因表达量增加了10倍。IE1启动子上游增加了hr5启动子CAT表达增加了5倍。除了hr增强子p143[62]基因的部分区域在昆虫和哺乳动物细胞同样具有增强子的作用。8 下调元件据报道，启动子区域中ATG密码子和小顺反子的上游区在杆状病毒基因表达中发挥调节作用。由于所处位置和环境，这些区域可以影响启动子的强度而且有下调基因表达的潜能。当对杆状病毒gp64晚期启动子内的天然小顺反子进行点突变，由于点突变干扰了小顺反子的功能导致gp64晚期启动子下游的报告基因表达水平提高。当对所有ATG密码子上游区域包括小顺反子区域进行突变，报告基因表达水平达到最大，表明小顺反子在杆状病毒基因表达中起负调控作用。类似的，Luckow通过改变多角蛋白启动子前导序列，构建了多个杆状病毒重组蛋白表达载体，来更好的理解翻译信号对蛋白高表达的重要作用。当多角蛋白部分编码序列与下游基因融合时，观察到更高水平的外源蛋白表达，同时连接多角蛋白部分序列的mRNA水平也更高。由于重组蛋白N端引入了额外的氨基酸序列，可能导致一些额外的不良影响，研究小组后来着手确认最优的高水平的非融合外源蛋白的表达方案。保持多角蛋白前导序列完整的同时将ATG突变为ATT,随后直接插入外源基因，外源基因的表达水平与野生多角蛋白表达水平相当。当多角蛋白启动子被突变为ATT，阅读框中含有含启动子的外源基因，此融合基因可以正常表达，但是表达水平要低于ATG未突变时。后来对该突变位点分析确定ATT为非常规的翻译起始位点，融合蛋白表达量为中等水平。在杆状病毒基因组中，39K ORF上游的IEO启动子前导序列中也含有小顺反子，表明这种调节作用存在于任何阶段。在BEVS中，通过改变这些上游调节区域序列可以控制蛋白的翻译水平。9 可诱导的杆状病毒启动子能够控制表达时间和表达量将有助于优化重组蛋白的生产，特别是在共表达伴侣蛋白或者表达的蛋白对宿主有毒时。这种杆状病毒表达系统包括瞬时质粒转染表达或者表达外源基因的稳定细胞株，杆状病毒启动子在感染后的某个时间点启动表达。早期基因启动子IE0,IE1和IE2常被用于可诱导启动子在非感染昆虫细胞中的持续表达。39K启动子属于早期延迟启动子，可以被感染的或者过表达的IE1诱导。将转录激活区域(-310 to -355）复制至核心启动子附近，合成出的最佳39K启动子，相比早期基因启动子获得了更高的蛋白表达量。该区域也可以添加到其他启动子前后来增加他们感染后的诱导表达能力。四环素诱导普遍应用于哺乳动物系统，并对杆状病毒表达系统进行了优化调整。p10或者果蝇hsp70启动子反式激活Tet，由pTRE-CMVmin启动子控制目的基因的表达。此系统被称之为Tet-Off，pTRE-CMVmin启动子一直表达目的蛋白，随着四环素的添加蛋白表达逐渐降低，当四环素添加至高剂量时蛋白表达近乎停止。或者，在培养基中预先加入四环素，然后更换不含四环素的培养基目的基因开始表达。通过移除独立于Tet激活系统的 pTRE-CMVmin的激活基因Ac-orf5，来达到更好的控制效果。利用压力诱导的启动子通过杆状病毒诱导蛋白质表达的复杂性在于感染过程中压力的积累通常会导致泄漏。果蝇hsp70启动子通过杆状病毒感染来诱导表达，同时还会被温度诱导表达。果蝇金属硫蛋白基因(Mtn）启动子整合到AcMNPV时可以被铜或者镉诱导。金属暴露延迟了病毒感染过程。宿主蛋白的合成比正常情况稍微延长，多角体蛋白形成延迟了1-2天。然而，铜处理延长了p10和多角蛋白启动子介导的转录过程，从而获得更高的蛋白产量。10 昆虫宿主启动子尽管前面提及的病毒启动子具有高转录水平，但是这些启动子许多都依赖于仅在感染周期后期才可用的病毒机制。在此阶段，由于感染引起的细胞病变使细胞完整性受到损害，一些报告表明蛋白生产和加工也可能受到损害。早期病毒启动子往往受到一些限制，而且转录活性不尽人意。为了克服上面这些缺点一种选择是选用昆虫启动子，昆虫启动子一般在感染周期早期转录，可以用于包括杆状病毒重组蛋白，转染质粒，稳转细胞株的外源基因表达。昆虫启动子还有助于研究人员从杆状病毒宿主细胞之外寻找表达外源基因的合适细胞系，因为研究发现在一些非易感的昆虫细胞中蛋白的表达有启动子依赖性。利用CAT报告基因，Johnson发现家蚕幼虫肌动蛋白启动子比多角体启动子有24小时的时间优势。尽管家蚕肌动蛋白启动子表达的报告基因蛋白水平要显著低一些，因为它的早期活性可以更快的累积毒性蛋白，从而可以用在生物害虫控制载体上。家蚕幼虫中这些类似的趋势表明家蚕幼虫肌动蛋白早期启动子具有替换传统晚期启动子的潜能。类似的，粉纹夜蛾幼年激素抑制蛋白2(pB2）启动子比晚期病毒启动子更早的激活[79]。pB2-p10嵌合体启动子与感染后的多角蛋白启动子和p10启动子相比，在感染24和48小时后，活性有所提高。在所有易感细胞系中，果蝇hsp70启动子的产量高于传统的早期病毒启动子。此外，在非易感细胞系中，昆虫衍生启动子优于所有时间类的病毒启动子。后来Lee将hsp70启动子用于果蝇S2细胞中杆状病毒介导的基因表达。除此之外，Bleckmann发现Sf21衍生的GAPDH 启动子的表达水平大约是早期病毒OPie1启动子和核糖体L34启动子的四倍。然而，昆虫衍生启动子的活性仍显著低于病毒OPie2启动子和增强的hr5-ie1-p10 启动子。11 多个重组蛋白表达BEVS在单个细胞中表达多个重组蛋白的能力是非常有用的，尤其是当需要生产多组分蛋白复合物或者某些蛋白需要额外的“辅助”蛋白时（如伴侣蛋白）。研究人员利用昆虫细胞表达多个蛋白有两种主要的方式：1.使用多种（单顺反子）杆状病毒共感染；2.使用单个多顺反子的杆状病毒或者含有多个重组表达盒的单个杆状病毒进行共表达。先前的研究表明，控制每种病毒的感染复数(MOI）应该可以控制每种蛋白的表达比例。然而，每种病毒需要多少制剂量只有理论值，而且通常不考虑细胞对重组病毒摄取的不一致性。随着病毒数量的增加，病毒感染等比的细胞比例出现下降。此外，细胞被多个杆状病毒感染时会发生高频重组，从而导致有缺陷的病毒而且无法表达预期的多蛋白产物。将多种蛋白质的基因插入单个杆粒，共表达，有助于克服细胞吸收的病毒分布不均匀的问题。从一种杆状病毒表达多种重组蛋白可确保每个感染病毒的细胞都表达所有重组蛋白。这种方法的一个缺点是无法严格调节每种蛋白质表达的比例。许多共表达系统利用强和非常晚的杆状病毒启动子多角体蛋白和p10，例如pFastBac Dual (ThermoFisher)，它包括两个相反方向的启动子。一种类似的双启动子构建体已被设计到杆状病毒中，以在几丁质酶和组织蛋白酶的缺失区域表达两种翻译后酶法尼基转移酶A和B，使多角体蛋白基因座attTn7可用于转座感兴趣的基因。虽然两种天然启动子都产生高产量的重组蛋白，但在某些情况下，这会导致靶蛋白量受阻。已经证明，表达多种蛋白质可以压倒昆虫细胞的蛋白质生产机制，特别是在宿主细胞功能下降的晚期裂解阶段。宿主细胞的改变可以为异源基因表达提供额外的空间。Piggybac载体用于将6个具有Tet诱导型启动子的糖基因添加到Sf9细胞中，从而产生能够表达哺乳动物化N-糖基化途径的菌株SfSWT5。后来，在39k病毒诱导的启动子控制下的9种糖原被包含在Sf39KSWT菌株中，以提高表达水平并改善N-聚糖加工。随着CRISPR-Cas9位点特异性编辑的进步，菌株可以进一步细化以实现特定目标。对于大量的重组蛋白，Berger的MultiBac系统包括将单个基因克隆到一系列供体载体中，然后通过Cre/loxP将它们重新组合成受体载体，最后组装到位于杆粒的多角体蛋白位点。MultiBac系统的进一步更新包括整合到杆状病毒基因组中的LoxP位点，以允许插入荧光标记用于转染/感染控制或其他伴侣蛋白。额外的插入可以通过生成多蛋白添加到系统中，其中包括蛋白酶和一系列ORF，每个ORF由蛋白酶切割位点分隔。单个蛋白质的切割发生在蛋白酶从多蛋白自切割之后。虽然这允许MultiBac平台的更大扩展，但它并非没有疤痕；当使用烟草蚀刻病毒切割位点时，残留物包括每个蛋白质C末端的六个氨基酸(ENLYFQ)和除第一个ORF（蛋白酶）之外的所有蛋白质的N末端的额外甘氨酸。其他实验室已经利用该平台进行了多种克隆方法和穿梭载体。USER（Uracil-Specific Excision Reagent）无连接克隆方法可用于对插入物进行无缝插入，最多可插入16个ORF。Macrobac涉及BioBricks组装和连接独立克隆(LIC)，最多可插入10个插入片段。OmniBac提供杆粒定位的灵活性，利用Tn7介导的转座进入多角体基因座，或同源重组进入ORF1629基因座。GoldenBac在一个系统中结合了MacroBac和OmniBac功能。biGBac策略使用带有优化链接器的Gibson组装，以允许合并多达25个插入。SmartBac有一套更通用的表达构建体，使用p10启动子进行非常晚期的高表达以及晚期p6.9，允许用户更好地控制表达时间和潜在的蛋白质质量。载体组的设计方式也允许在大的外来插入物在病毒传代过程中不稳定的情况下允许合并感染。在这样的多蛋白系统中，化学计量可以通过包含给定基因的多个拷贝来控制。或者，当需要较低的表达时，该基因可以定位在更接近转录物末端或在替代启动子的控制下。最近报道的是PolyBac穿梭载体，它扩展了可用于插入异源基因的选项。三个重组位点—loxP，attR1/attR2和传统的mini attTn7—在遥远的位置可用，允许在每个位置进行多个转基因的Cre-Lox重组、Gateway重组或Tn7转座。研究人员利用各种启动子优化单个蛋白质的时间和质量，通过这种先进工具成功添加糖基化途径。为了避免表达蛋白酶和相关的残留氨基酸，研究人员还使用内部核糖体进入位点(IRES)来生成多种重组蛋白。水稻病毒(RhPV)5‘UTR已成功应用于双反子系统，并与水稻病毒(PnV)5’UTR联合用于三反子载体。另一项研究发现，在DNA-双荧光素酶检测中，蚜虫致命麻痹病毒(ALPV)、黑皇后细胞病毒(BQCV)、板球麻痹病毒(CrPV)和果蝇C病毒(DCV)IGR IRES的活性是背景的3-4倍。然而，IRES下游的orf的表达水平低于第一个转录本。如果考虑插入物的大小，2a的自裂位点比IRES要小得多，可以用来从单个mRNA中生成两个蛋白质。核糖体暂停在2A位点的c端甘氨酸，并在翻译过程中再次开始于脯氨酸。在使用这种策略时，会有一些残留的氨基酸，并不是种群中所有的蛋白质都会被裂解，但这两种期望的蛋白质的比例更相似。四种这样的2A多肽(P2A、T2A、E2A和F2A)已经在培养的果蝇细胞和体内进行了不同水平的效率测试[105]。另一种方法利用泄漏核糖体扫描机制。在这种方法中，多顺反子中的第一个或第二个ORF由非规范起始位点起始，最终翻译使用标准ATG起始密码子。虽然大多数翻译将在规范起始处启动，但核糖体复合体将在一定百分比的时间在先前的弱起始密码子处启动。这在重组蛋白的所需比例是含有大量一种而另一种较少的情况下是有用的。Urabe利用非规范起始密码子来改变rAAV衣壳蛋白的表达水平。改变起始密码子导致AAV在Sf 9细胞中成功复制，三种VP蛋白从单个mRNA 转录物以更等效的水平产生。虽然可能需要几组实验来确定这些系统中给定复合物中每种蛋白质的最佳位置，但现在比以前版本的杆状病毒系统更容易完成。12 结论虽然在杆状病毒表达系统技术方面取得了重大进展，但对于系统中不同类别蛋白质的最佳表达没有一致的预测算法。有很多选择可用于驱动表达，但市场上很少有现成的。当考虑重组分子伴侣或翻译后修饰酶时，在感兴趣的基因之前表达这些蛋白质可能是有益的，从而允许非常晚的转录因子完全可用于生产感兴趣的基因。在这些情况下；对非目标蛋白使用更早或更早的启动子可能是有益的。或者，当表达包含复合物的蛋白质时，可能需要使亚基以相似的比率和时间范围表达。开发包含易于交换的启动子、增强子和伴侣的杆状病毒工具包将有助于对复杂蛋白质和蛋白质复合物进行经验测试。用更广泛的启动子生产困难蛋白质的系统性努力可以预测未来更高通量的努力。鉴于现在可以包含在新的杆状病毒表达载体中的大量ORF，未来的努力可能包括选择在更大范围的裂解周期中利用表达，更好地控制化学计量，以及更周到地使用昆虫细胞蛋白质生产机械。原文来源：Carissa Grose , Zoe Putman, Dominic Esposito.A review of alternative promoters for optimal recombinant protein expression in baculovirus-infected insect cells.Protein Expression and Purification.Volume 186,October 2021, 105924