2024年9月，国际知名药企辉瑞（Pfizer）与成都先导（HitGen）联合在线发表了题为《Discovery, characterization, and structure of a cell active PAD2 inhibitor acting through a novel allosteric mechanism》的研究论文。该论文报道了通过DNA编码化合物库（DEL）筛选发现的首个具有细胞活性、高选择性的非共价PAD2抑制剂PF-3166，该抑制剂通过一种新颖的钙竞争性变构机制作用，为开发治疗多种炎症和自身免疫性疾病的新药提供了全新思路。
文章地址：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acschembio.4c00397
瓜氨酸脱亚胺酶（PAD）是一类能够催化蛋白质中精氨酸残基脱亚胺形成瓜氨酸的酶家族。在人类中，共有五种PAD同工酶：PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6。瓜氨酸化的发生会改变蛋白质的正电荷，进而影响其结构、相互作用、稳定性和功能。这种翻译后修饰被认为在调控蛋白质的时空活性中发挥重要作用。其中，PAD2因其在多种组织中的广泛表达和在疾病中的关键作用而备受关注。研究表明，PAD2与炎症反应、败血症、乳腺癌和多发性硬化症等多种疾病密切相关，其异常活性可能导致过度的瓜氨酸化，进而影响细胞功能和免疫反应。
然而，开发对PAD2具有高选择性的抑制剂一直是一个巨大的挑战。目前，许多PAD抑制剂都是不可逆的共价抑制剂，缺乏对PAD同工酶的特异性，可能导致副作用并限制其临床应用。此外，这些抑制剂通常通过与活性位点的关键半胱氨酸残基共价结合，难以实现对特定同工酶的选择性抑制。为了解决这些问题，科学家们一直在探索新的化学空间和作用机制，以开发非共价、可逆且具有高选择性的PAD2抑制剂。然而，由于PAD同工酶之间的高度同源性，这一目标一直难以实现。
在此研究中，研究团队利用了成都先导的DNA编码化合物库（DEL）技术，旨在发现具有新颖结构和作用机制的PAD2抑制剂。通过DEL技术，可以在一次筛选中同时测试数十亿甚至数千亿个化合物，大大提高了筛选效率。本研究一共筛选了包含超过815亿种不同化合物的DEL库，对全长人源PAD2进行了多种条件下的筛选。在筛选过程中，设置了多种变量，包括不同的钙离子浓度、PAD2的负载量以及与已知PAD抑制剂的竞争条件等。通过三轮的筛选和富集，最终发现了3个具有不同化学结构的化合物系列：PF-3166、PF-8522和PF-2635（图1）。
图1. 通过DEL筛选发现的3个PAD2化合物：PF-3166、PF-8522和PF-2635
其中，PF-3166展示出了最高的亲和力和抑制活性（图2）。荧光淬灭酶活性测定结果显示，PF-3166对PAD2的抑制活性IC₅₀为150nM。采用氨释放检测法，进一步确认了PF-3166对PAD2的抑制作用，IC₅₀为580nM。
图2. DEL化合物对PAD2的抑制效果。A）荧光淬灭法检测化合物对PAD2催化活性的抑制。B）氨释放测定法进一步评估PF-3166对PAD2的抑制作用，确认其高效性。C、D）在不同钙离子浓度下，PF-3166对PAD2（C）和PAD4（D）活性的抑制曲线。
为了评估3个DEL抑制剂的选择性，研究人员测试了其对PAD3和PAD4的抑制作用（图3）。结果表明，抑制剂在高达80µM的浓度下，对PAD3和PAD4均无显著抑制作用，显示出对PAD2的高度选择性。
热漂移分析（TSA）和亲和力质谱筛选（ASMS）的结果也进一步验证了PF-3166与PAD2的特异性结合（图4），且PF-3166与PAD2结合后显著提高了蛋白质的熔点温度，但在添加高浓度钙离子后，这种稳定作用被削弱，表明PF-3166的作用与钙离子存在竞争关系。
图3. DEL化合物与PAD2的特异性结合。A）亲和质谱筛选显示PF-3166等化合物与PAD2结合，但不与PAD4结合。B）化合物与PAD2的结合曲线，展示了结合强度和亲和力。
图4. DEL化合物对PAD2的热稳定性影响。A）PF-3166等化合物提高了PAD2的热稳定性。B）对PAD4的热稳定性无明显影响。C）在不同钙离子浓度下，PF-3166等化合物对PAD2热稳定性的影响。
为了深入研究PF-3166的作用机制，研究团队进行了X射线晶体学分析。成功解析了PF-3166与PAD2的复合物结构，分辨率达到1.64Å（图5）。结构数据显示，PF-3166结合在PAD2二聚体的界面上，与两个蛋白亚基均有相互作用。PF-3166的Cl-双苯醚基团深入插入二聚体界面，主要通过疏水相互作用与Trp550A、Tyr463A、Pro281B和Pro284B等残基结合。同时，PF-3166的结合导致PAD2特定区域的显著构象变化，特别是导致CA1和CA2钙结合位点的重排和钙离子的释放（图6）。
图5. PF-3166与PAD2的晶体结构解析。A）PF-3166以2:1的比例与PAD2二聚体结合。B）PF-3166在结合口袋中的详细位置。C）PF-3166的结合导致PAD2结构中440 loop的显著位移。
由于PAD2的酶活性高度依赖于钙离子的结合，PF-3166的作用阻断了酶的活化过程，从而有效地抑制了酶的催化功能。另外两个化合物PF-8522和PF-2635，虽然也与PAD2结合，但在功能活性上表现出差异，因为结合并未引起钙结合位点的构象变化，也未导致钙离子的排出，因而不具备抑制PAD2活性的能力。这一发现进一步支持了PF-3166的独特作用机制，强调了引起钙离子释放对于抑制PAD2活性的关键性。
图6. PF-3166引起PAD2钙结合位点的重排。A）PAD2中钙结合位点CA1的正常配位状态。B）PF-3166结合后，CA1位点的构象发生变化，钙离子被排出。C）PF-3166导致Arg347与Gln350之间的氢键释放，影响酶的活性。
在细胞水平上，PF-3166也展示出了显著的活性（图7）。在人中性粒细胞的实验中，PF-3166能够有效地抑制离子霉素刺激下的总瓜氨酸化水平，IC₅₀约为3µM，最大抑制效果达到70%。相比之下，PAD4选择性抑制剂GSK199在相同条件下的抑制效果仅为25%。当同时使用PF-3166和GSK199时，瓜氨酸化水平的抑制效果接近100%，这表明在中性粒细胞中，PAD2和PAD4共同参与了瓜氨酸化过程。
图7. PF-3166在细胞水平的活性。A）PF-3166在人中性粒细胞中抑制总瓜氨酸化水平的效应。B）PF-3166对组蛋白H3瓜氨酸化的特异性抑制。
本研究通过DEL技术成功发现了具有新颖作用机制的PAD2高选择性抑制剂PF-3166，为开发针对炎症和自身免疫性疾病的新型治疗药物奠定了重要基础。PF-3166的钙竞争性变构抑制机制代表了一种全新的酶抑制策略，可能适用于其他依赖金属离子的酶类。未来的研究将集中于对PF-3166进行进一步的优化，以改善其药代动力学性质和生物利用度，如提高溶解度、降低分子量和增加细胞渗透性。此外，PF-3166作为研究工具，有望帮助科学家深入揭示PAD2在各种生理和病理过程中的具体作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路。
参考文献:
Byrnes, Laura J., et al. "Discovery, Characterization, and Structure of a Cell Active PAD2 Inhibitor Acting through a Novel Allosteric Mechanism." ACS Chemical Biology (2024).
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