Betulinic acid

赛多利 斯集团 生物层干涉技术 小分子应用文集 简介 赛多利斯集团成立于 1870 年，总部位于德国哥廷根，是国际领先的生命科学研究和生物制药行业合作伙伴。集团的实验室产品及服务部门为生物制药企业以及各类科研机构提供创新的实验室设备及产品，以满足客户开展高端科研实验和严苛的质控需求。集团的生物工艺解决方案部门提供全套的生物制药设备，并专注于一次性解决方案，帮助客户安全高效地生产生物药品和疫苗。 Octet®   分子相互作用技术平台包括仪器、生物传感器和相应试剂盒，是一种非标记的、实时监测的先进技术，主要用于生物分子间相互作用动力学参数以及蛋白浓度的测定。该平台通过浸入即读的检测方式（Dip and ReadTM）来提高检测通量，简单易学并有利于优化操作流程，使用户能在数分钟内就可以获得大量的可靠数据。在很多应用领域中，这种技术平台可以有效地替代 ELISA、HPLC 以及 SPR 等分析方法。 生物分子间的相互作用是所有生命现象发生的基础，研究其相互作用可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质。通常从化学的角度上说分子量小于 1000  道尔顿的分子统称为小分子，从生物角度上说，小分子就是具有生物活性的小肽、寡肽、寡糖、寡核苷酸、维生素、矿物质、植物次生代谢产物及其降解产物如苷元、黄酮元、甙元、生物碱等。小分子涵盖了纳米科学与生物科学、化妆品科学、营养科学、中草药科学、中医科学、医药科学等多学科领域。因此，深入研究小分子与相关生物分子的相互作用有助于研究人员更好地揭示生命活动的本质。 目 录 卷首语 生物层干涉技术原理 小分子文集摘要 揭开小分子与蛋白质的 互作秘密 在生命科学研究领域，了解小分子与蛋白质之间的相互作用对于新药发现、疾病治疗及生物过程研究具有至关重要的意义。然而，这些应用往往因技术限制而充满挑战。现在，借助基于生物层干涉技术（Biolayer Interferometry, BLI）的 Octet®非标记分子互作分析系统，我们以非凡的精度和灵敏度实时监测小分子与蛋白质的互作，为生命科学研究打开全新的篇章，在不同典型应用场景中的体现独特优势。 一、药物发现 在药物发现的漫长旅程中，科学家们需要不断地寻找和优化药物候选者。通过受体和配体的理论，小分子药物的功能发挥是需要和蛋白质靶标相互作用过程中发生的。小分子药物与蛋白质靶标之间的相互作用是小分子药物发挥效果的过程， 目前评价小分子药物和蛋白质靶标相互作用的主要方式有稳态分析和动力学分析两种。稳态分析是通过结合前和结合后两个时间状态对小分子与蛋白质靶标之间的亲和作用进行分析，但这并不能完全分析或解释药物的作用效果。虽然稳态分析在很多的实验中证实了它的客观性和有效性，但是动力学分析在很多实例中显现出了对相互作用过程更为准确的描述。越来越多的工作关注于小分子药物与蛋白质靶标之间相互作用动力学过程。在具体药物的疗效评价中，药物本身的浓度变化可能快于药物与蛋白质靶标的结合或解离的速度，此时稳态分析很难给出具体的描述，而药物与蛋白质靶标之间的动力学过程的结合与解离将更适宜反映药物的效果。根据药物与疾病相关的体内靶标之间的亲和力差异，可以有效地评价药物可能产生的疗效。这一过程涉及确定药物与目标生物分子的相互作用，以便评估其疗效和安全性。Octet®   非标记分子互作分析系统通过实时监测和分析小分子药物与蛋白质靶点之间的相互作用，为先导化合物的优化和药物设计提供了强有力的支持。小分子药物与蛋白质靶标之间的动力学分析常数，能够提供比稳态分析常数更为丰富的相互作用信息。 1.1 药物筛选 在药物筛选过程中，Octet®   能够快速准确地确定哪些药物候选者与目标生物分子相互作用。通过自动化数据分析，研究人员能够快速筛选出有潜力的先导化合物，避免了传统生物学方法耗时费力的缺点。 1.2 药物作用机制研究 除了筛选药物候选者，Octet®   还可以用于研究药物的作用机制。通过对药物与目标生物分子的相互作用进行深入分析，研究人员可以了解药物在细胞内的作用方式和作用靶点，为药物开发提供理论支持。整合日益发展的 AI 技术，将药物作用机制的互作数据用于训练 AI 大数据模型，融合人工智能，利用 “反馈—迭代” 机制，深度挖掘隐藏在海量数据背后的信息。 1.3 药物效果评估 在临床前研究中，评估药物的疗效和安全性是至关重要的。 Octet®  可以评估药物对生物大分子的影响，包括抑制、激活或调节生物大分子的功能。通过对药物效果的全面评估，科学家们可以更好地评估药物的潜在疗效和安全性。2021版 USP（美国药典）收录 BLI 技术就是最好的证明。 二、生物分析 在生物分析领域，Octet®   可用于研究生物分子间的相互作用。这些相互作用在许多生物学过程中起着关键作用，例如细胞信号转导、基因表达以及疾病的发生机制等。 2.1  研究生物分子间的相互作用 利用 Octet® , 科学家们可以研究两种蛋白质之间的相互作用，揭示疾病的发生机制或生物过程中关键分子之间的相互调节作用。这些研究结果有助于深入理解复杂的生物系统。互作研究中，关键信号传导节点的小分子抑制剂或竞争结合分子也是目前生命科学研究的热点与重点。Octet®以其开放的检测程序设计，能够更好地帮助科学家严谨地执行研究方案。 2.2 生物标志物发现与研究 生物标志物是反映疾病发生、发展和转归的重要指标。利用 Octet® , 科学家们可以研究体内小分子（化合物、小肽等）在不同生理和病理条件下的变化情况，以便发现新的生物标志物并评估其潜在应用价值。 2.3 生物医学研究 在生物医学研究中，细胞信号转导通路是生命活动中的基础环节之一。利用 Octet® , 科学家们可以研究特定细胞信号转导通路的调节作用及其与疾病的关系。这些研究有助于发现新的药物靶点并为开发创新药物提供理论支持。 Octet®   非标记分子互作分析系统可以帮助科学家们深入了解小分子化合物对细胞信号转导和基因表达等过程的影响。这些研究对于疾病的发生机制、药物作用机制以及治疗方法开发具有重要意义。 三、环境监测 在环境监测方面，Octet®   可用于评估小分子污染物对生物大分子的影响。这些污染物可能来自工业废水、农业化学制品或生活垃圾等。通过监测污染物与生物大分子的相互作用，科学家们可以评估环境污染的程度以及制定相应的治理策略。 3.1 污染物与生物大分子相互作用研究 环境中的有害物质往往通过与生物分子相互作用产生毒性。借助 Octet® , 我们可对环境中的有害物质进行快速准确的检测，及时预警可能对健康造成的危害。此外，对于环保领域的研究人员来说，Octet®   还能帮助他们深入了解污染物对生物大分子的影响机制，为环境保护提供科学依据。 Octet®  的高灵敏度、宽泛的样品检测范围、极低的使用成本、高度的可靠性提供了广阔的研究空间，便于科学家在已有的传感器基础上改良、创新出更具有想象力的检测方法。 3.2 生态毒理学研究 生态毒理学是研究有毒物质对生物体和生态系统的毒性效应及其作用机制的学科。通过使用 Octet® , 科学家们可以研究有毒物质与生物大分子的相互作用，为环境保护和生态修复提供重要依据。在生态毒理学的研究中，可以利用Octet®   无流路的特点，将环境样本中的典型污染物收集后进行质谱鉴定，绘制污染物分布图谱，为进一步针对性制定方案指明方向。 相较于传统的检测方法，Octet®非标记分子互作分析系统具有以下优势： ●样品需求量低：相较于传统的互作检测方法，Octet®   需要的样品量极低，这对于珍贵样品的研究具有重要意义，摒弃了流路设计，所有样品在检测后都可以回收再利用。  无需标记：不同于荧光或同位素标记的互作技术，Octet®采用了非标记技术，样品无需进行任何预处理，这大大降低了实验的复杂性，提高了实验的准确性。 ●实时监测：Octet®   可以对生物分子间的相互作用进行实时监测，这一点是其他技术无法比拟的。实时监测使得我们可以捕捉到动态的相互作用过程，对于理解分子互作的机制具有重要意义。 ●高通量分析：Octet®   可以进行高通量的筛选和分析，大大提高了实验效率，降低了实验成本。这对于药物发现、环境毒理、疫苗研发等应用场景具有重要意义。 ●易于操作和维护：相较于其他技术，Octet®   的操作和维护相对简单，对于实验人员的要求较低，大大降低了使用成本。 综上所述，Octet®   非标记分子互作系统在药物开发、生物过程研究、疾病治疗及环境监测等领域展现出巨大的应用潜力。这不仅为我们揭示了小分子与蛋白质之间的相互作用奥秘，还为生物医药领域的发展提供了强大的技术支持。让我们携手拥抱这一创新技术带来的无限可能，共同探索生命科学的新前沿！ 生物层干涉技术原理 生物层干涉（Bio-Layer Interferometry）是一种非标记技术，它将发生在 BLI 生物传感器表面的光干涉信号转化为实时的响应信号。通过对分子结合过程的实时监测，系统会测定结合常数（ka 或 kon）和解离常数（kd 或 koff), 以及起始结合速率，并通过拟合计算分析得到亲和力（KD）和浓度信息。 Octet® 生物传感器由玻璃光纤制成，并在玻璃光纤的末端外加了特殊的光学层。该光学层为配体的固定提供了表面化学基质（图 1）。白光（包括可见光谱中的所有波长）被引入玻璃光纤中，并在顶端的两个界面处产生部分内部反射 : （1）玻璃光纤和光学层之间（恒定）的界面；（2）表面化学和溶液（可变）接触的界面（图 2A）。这两个界面产生的两路反射光会引发光干涉现象（图 2B），仪器会对每个波长的干涉光强度予以测量记录，并生成干涉光谱曲线（图 2C）。经历相长干涉的波长在光谱曲线上显示为高振幅，而经历相消干涉的波长则显示为低振幅。Octet® 相互作用分析仪就是通过实时测量干涉光谱曲线的变化，以实现检测分子间相互作用的目的。 当分子与固定在生物传感器表面上的配体结合时，引起光学层的厚度增加，第二路反射光的路径长度比之前更长（图2D）。这导致干涉光谱曲线发生改变，并向右产生位移。当分子和配体解离时，分子会从生物传感器表面解离到溶液中，这将导致干涉光谱曲线向左移动。以干涉光谱曲线的偏移距离（以 nm 为单位）与反应发生时间绘制的关系图被称为传感图（Sensorgram）。通过传感图，可在各种结合模型的基础上拟合出 ka，kd 和 KD（图 3）的数值。 BLI 动力学实验流程 图 4 展示了在 Octet®  仪器上测定结合动力学的标准流程。Octet® 的生物传感器提供多种化学界面，无需修饰即可快速轻松地固定配体。动力学传感器均可再生和重复使用，以进一步降低生物传感器的消耗和使用成本。在多通道、高通量Octet® 系统中，可以同时平行检测多对结合反应，缩短实验运行时间，例如文库筛选、表位分类、实验条件优化、浓度梯度依赖性结合分析等。 BLI 定量实验流程 BLI 技术可用于定量分子的浓度，例如 IgG、Fc- 融合蛋白、人 Fab、含 HIS 标签或 GST- 融合重组蛋白。应用 Octet® 或Octet® N1(BLItz) 系统，生物传感器可在几分钟内确定纯化后或粗制样品中特定分析物的浓度。由分析物与生物传感器结合产生的结合曲线，其结合速率与分析物浓度是有相关性的（图 5）。目前 Octet® 有针对检测 Protein A、HCP 残留、唾液酸含量以及甘露糖含量的商业试剂盒。用户也可以在 Octet® 系统上轻松开发自己所需的高灵敏度定量分析方法。 小分子文集摘要 1. 细胞宿主防御新机制 模式识别理论是现代免疫学的基石之一，寻找和鉴定新的病原相关分子模式及其相应的模式识别受体是当代免疫学研究中“皇冠上的明珠”。历史上每发现一条新的模式识别通路，都无一例外地开辟了新的免疫学研究领域，其引发的研究热潮也会促进人类对免疫系统与病原微生物互作机制的认知。 NIBS 邵峰院士课题组首次探明了细菌中的庚糖分子 ADP-heptose 引发了宿主免疫反应，宿主体内的 ALPK1 来直接感应 ADP-heptose。 该研究首先使用转座子筛选法鉴定出了激活天然免疫缺陷的菌株，从而找出病原相关分子模式的庚糖代谢物是 ADP-heptose （ADP-β-D-manno- heptose）。通过 CRISPR-Cas9  高通量筛选的方法，研究组进一步找出了 无 法 识别 ADP-heptose 刺 激的 基 因 缺陷 细 胞，从 而 确定 了 识别ADP-heptose 的模式识别受体是 ALPK1。 然而，ALPK1 究竟能否直接与 ADP-heptose 结合呢？研究人员考虑和尝试过多种实验方法验证 ALPK1 与 ADP-heptose 结合，但都由于标记导致蛋白活性、耗材价格昂贵等问题没有获得理想的结果，最终研究人员采用温和的方式 -  蛋白生物素标记，然后将其固化至链霉亲和素传感器，通过Octet® 验证了 ALPK1 与 ADP-heptose 结合 ( 图 1 所示 )。 Octet® 提供直接确凿的证据，证实 ALPK1 是 ADP-heptose 直接受体，从而描绘出一条完整的信号转导通路：ADP-heptose 进入宿主细胞先与ALPK1 结合，随后磷酸化 TIFA，与 TRAF6 作用后最终激活 NF-kB 通路，这具有非凡的原创性和实际应用价值（图 2 所示）。 邵峰院士也因为这个研究获得了 2019  年未来科学大奖，以表彰其发现人体细胞内对病原菌内毒素 LPS 炎症反应的受体和执行蛋白。在基础生命科学研究过程中，每一个新的发现与突破的背后都是研究人员的不断尝试的结果，而选择一个合适准确的方法，可以帮助研究人员更加快速准确的获得突破性的结果。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Zhou, P., She, Y., Dong, N. et al. Alpha-kinase 1 is a cytosolic innate immune receptor for bacterial ADP-heptose. Nature 561, 122–126 (2018). 2. 小分子垂钓与验证 人参有助于调节大脑兴奋性、促进学习记忆和抵抗中枢神经系统的脑缺血。人参皂甙是人参的主要活性成分，但它们在大脑中的蛋白质靶点尚未确定。研究人员通过亲和层析和 pulldown  方法鉴定 14-3-3ζ蛋白为人参皂苷的脑组织内潜在靶标。生物层干涉法（BLI）分析表明，皂苷代谢产物 20（S）-  原人参二醇（PPD）对 14-3-3ζ蛋白的相互作用的亲和力最强。随后，BLI 动力学分析和等温滴定量热法（ITC）分析表明，PPD 与 14-3-3ζ蛋白特异性结合。14-3-3ζ蛋白和 PPD  复合物的共晶结构表明 14-3-3ζ蛋白的残基R56、R127 和 Y128 参与 PPD 结合。突变上述任何残基都会导致 PPD 和 14-3-3ζ蛋白结合亲和力的下降。这一发现有助于开发与 14-3-3ζ结合的达马烷型三萜类结构的小分子化合物。Octet®   不仅可以验证中药有效成分与靶点的结合，还可以证明进一步验证结构解析的结果。 在药物开发过程中，及时了解药物的构效关系，可以更好的设计和优化药物结构。在此过程中需要测试不同关键位点氨基酸突变体与药物的结合活性，而 BLI 技术使用的 SSA 传感器为预包被形式且单个传感器的成本低，可以低成本快速的实现药物的构效关系研究。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Chen F/ et al. Identification and confirmation of 14-3-3 ζ as a novel target of ginsenosides in brain tissues. J Ginseng Res. 2021 Jul;45(4):465-472. 3. 垂钓中药有效成分 阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病，是一种不可逆转的、不可治愈的神经退行性疾病。AD 与β-amyloid (Aβ) 的纤维化密切相关，会引发神经炎症和神经元的死亡。在 AD 早期靶向抑制 Aβ 纤维的形成已成为目前 AD 治疗的有效策略。西南医科大学研究人员将生物层干涉技术与高分辨质谱作为钓钩，以 Aβ 作为诱饵来发掘中药开心散中 Aβ 的小分子抑制剂。 用户之声：“这篇文章开发了一种通过 Octet®   从天然药物尤其是中药复方中鉴定出抑制 Aβ活性的快速、简洁、可靠的高通量筛选方法，这为从天然药物中发现先导药物提供了很好的参考。” 参考文献（点击下方文献阅读原文） Guo M, et al. High-throughput screening for amyloid-β binding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLC-DAD-Q/TOF-MS/MS. Acta Pharm Sin B. 2022 Apr;12(4):1723-1739. 4. 虚拟筛选与结合验证 CDC37  由于其在致癌信号网络中的重要作用，已成为抗肿瘤化疗中一个有前途的靶点。为了发现新的CDC37 抑制剂，从雷公藤红素中建立了一个基于形状的模型。通过高通量虚拟筛选出几种与雷公藤红素具有高度结构相似性的五环三萜，其中乙酸桦木酸最具吸引力。基于生物层干涉法（BLI）的 Octet®  检测表明，乙酸桦木酸与 CDC37 结合的KD 值（25.7μM）与雷公藤红素的 KD 值相当。该化合物对一系列肿瘤细胞系表现出相当的抗增殖活性。乙酸桦木酸可以被认为是第一个通过非共价结合与 CDC37 结合的抑制剂。为了研究该化合物的构效关系，合成了乙酸桦木酸的 11个衍生物，并用 Octet®   测定它们和 CDC37  的亲和力。 Octet® 可以从结合活性上对小分子的构效关系进行解析。 Octet® 在小分子药物检测中具有高通量，耐受有机溶剂，灵敏度高等优势，非常适合用与小分子药物的构效关系研究，快速获得结果，准确分析构效关系，从而进行最优小分子药物的设计。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Bao QC/ et al. Betulinic acid acetate/ an antiproliferative natural product/ suppresses client proteins of heat shock protein pathways through a CDC37-binding mechanism. RSC Advances. 2016;6(48):42537-42544. 5. 高通量小分子化合物库筛选 基于生物传感器的片段化合物筛选是药物研发过程中一个非常具有价值的工具。这种方法优于许多其他的生化方法，因为初级苗头化合物可通过具体的结合图谱以及响应值有效地从非特异性或非理想的相互作用中区分开来，从而减少假阳性。来自罗氏公司的研究人员利用 BLI 技术通过模型系统和充分验证的靶点进行了小分子的检测和片段化合物的筛选验证，获得的亲和力常数和结合效价与表面等离子共振（SPR）技术高度一致。 在该项研究中，研究人员重组表达纯化得到 AVI-Tag 生物素标记的蛋白或通过体外的方式标记生物素（biotin-LCLC-NHSS），将其固化至 SSA 传感器上。通过缓冲液建立基线噪音信号，以基线噪音信号的 3 倍标准差为 cut-off 值筛选苗头化合物。使用了包含 6500 种化合物的片段文库对设计 PPI 的 BCL-2、 JNK1、eIF4E 进行了筛选，比较了这些靶标苗头化合物的比率。其中，eIF4E 同时包含 PPI 位点和核酸结合位点，与高通量的时间分辨荧光分析筛选得到的结果也进行了对比。 结果显示，BLI 技术通过双扣除的方式（参比传感器与零浓度的分析物），可以精准快速的进行数据的处理与分析（图 1），也在初级苗头化合物的筛选以及评估（图 2，图 3）中具有非常好的应用价值，可帮助确认生化分析法得到的化合物， BLI 技术可鉴定非典型的结合（图 3 中 F-I 随着化合物的浓度提高并不能达到饱和信号，信号大于阳性化合物信号 3倍以上，对于片段化合物不可能的慢解离）和筛选生化分析法未筛选得到的化合物。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Wartchow/ C. A. et al. Biosensor-based small molecule  fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25/ 669 676 (2011). 6. 小分子化合物筛选 急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是 造血系统的髓系原始祖细胞恶性增殖性疾病。AML  的发病机制研究和临床前研究取得了进展，但 AML 患者的 5 年生存率仍然较差。因此，临床上亟须开展基于新靶点、新机制的抗 AML 药物研究。中国科学院广州生物医药与健康研究院许永团队报道了一系列高结合活性和高选择性的 BET BD2 小分子抑制剂，可作为抗 AML 的候选药物。研究人员通过 生物层 干涉技术 测定了 BET（Bromodomain andExtra-Terminal Domain）家族成员与小分子抑制剂之间的结合动力学，从分子水平验证候选分子的构效关系。 BET 家族成员包括 BRD2、BRD3、BRD4 和 BRDT，每个家族成员都具有两个 N 端串联的溴结构域（BD1 和 BD2），利用生物层干涉技术分别测试了三种小分子 compound 3, 8land 8m 与其动力学。BLI 技术测试时间短，一般 10 分钟可以完成实验，可以更快速拿到实验结果。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Structure- Based Discovery and Optimization of Furo[3/2-c]pyridin-4(5H)-one Derivatives as Potent and Second Bromodomain (BD2)-Selective Bromo and Extra Terminal Domain (BET) Inhibitors.J Med Chem.2022/ 65/ 5760-5799 7. 小分子化合物库筛选 在全球范围内，抗击新冠病毒的药物研究一直是备受关注的热点。目前已上市的新冠药物主要以病毒的蛋白酶和聚合酶为靶点。随着时间的推移，已有抗新冠病毒药物逐渐出现耐药性问题。为了迎接这一挑战，崔胜课题组将焦点转向新冠病毒中保守结构域 nsp3  的 SUD  蛋白。他们将Octet®   作为高通量筛选工具以及创新的筛选方式，成功地发现了潜在的治疗药物 TF3。 研究人员将目光聚焦到 SARS-CoV-2 nsp3 的 SARS 独特结构域（SUD），解析晶体结构并用 Octet®  验证其与 G4-RNA的结合功能。为了寻找靶向 SUD  的潜在药物，研究人员使用 Octet®   对核酸类和激酶抑制剂小分子药物库进行了高通量筛选，结果分析时开创性的使用了多参数进行多维度的筛选（图 1）。 亟待解决的下一个问题是 compound 1-4 是否可以阻断SARS-CoV-2 SUD core 与病毒和宿主 G4-RNA  的结合？ EMSA 结果显示，Comp.4 可以破坏 SUD-G4 相互作用。采用 Octet®  进一步验证，Comp.4 最有效地破坏 SUD-G4相互作用，Comp.2 和 Comp.3 较弱。 这一突破性的研究不仅凸显了 Octet®  非标记分子互作系统在药物研发中的关键作用，还为应对新冠病毒变异和耐药性问题提供了全新的思路。在该研究中， Octet®  不仅用于药物的结合活性筛选与验证，而且可以用于靶点阻断分析，无流路设计结果更直观且准确可靠。通过精确的蛋白质相互作用分析，崔胜课题组成功地挖掘出 TF3(Comp.4)，这可能成为未来新冠病毒治疗的重要利器。 图1. 化合物筛选策略示意图 第一轮：从 1770 种化合物库中根据 R2（拟合度）选择 719 种化合物； 第二轮：基于结合亲和力（KD）值，其中包括 198 种化合物； 第三轮：基于解离速率常数（koff),选择 19 种慢解离的化合物； 第四轮：基于多浓度梯度计算的准确 Kd 值与熔解温度（Tm），最终选择四种具有高亲和力及高热稳定性的化合物（Com.1-4） 图 2. Octet® 数据：固化 RNA（G4-TRF2），与 SUD-core 蛋白和化合物的混合物结合；如果化合物有阻断作用，则混合物的结合信号降低 参考文献（点击下方文献阅读原文） Qin/ B. et al. Identification of the SARS-unique domain of SARS-CoV-2 as an antiviral target. Nat Commun 14/ 3999 (2023). 8. 小分子药物筛选策略 基于生物传感器技术在药物发现方面变得越来越重要，而小分子药物一直是市场主力军之一。来自德国维尔茨堡大学的研究人员，建立了基于生物层干涉 (BLI) 技术的片段筛选策略，为小分子药物筛选提供了新的思路和方法。 筛选流程 图1 图 2 图3 图 4 研究人员将 ADP 作为阳性小分子，用 BLI 测定其与 p97 蛋白的动力学参数，结果与报道一致。证明这个方法和体系可以用来筛选 p97 靶点的化合物（图 1）。 如图 2 所示，用 p97 的 ND1 结构域（a）和 N 结构域（b）进行初始 679 个化合物的 BLI 筛选，（c）和（d）图中图中红色为信号较大的候选药物。 初步筛选出的候选小分子进行多浓度动力学测试，发现其中36 种化合物表现出剂量依赖的反应信号。a 化合物没有明显信号，b 化合物随着浓度的增加表现出非饱和反应，c 化合物在较高的浓度下表现出双相曲线，e 化合物是最佳曲线（图 3）。 之后，使用 ScoreBLI( 如图 4 所示，包含拟合度等指标 ) 作为标准，筛选 Score BLI>0.7 的片段化合物，得到 13 个分子，同时选取动力学拟合和稳态拟合数据相差较小的十个片段作为最终候选化合物。在分子动力学模拟的指导下，使用基于蛋白质和配体的 NMR 技术以及 X 射线晶体学假设并实验验证了所选筛选 hit 的结合位点，最终产生了具有 p97 N 端结构域的小分子复合物的第一个结构。 文章作者强调： BLI  是一种适合于片段筛选的生物物理方法。与其他生物传感器平台相比， BLI 作为一种无需流体系统的方法，具有更易于设置和处理的优势。目前的研究表明， BLI  是一种适合于检测低分子量化合物结合的方法，为基于片段的药物设计提供了有前途的候选方法。因此， BLI 是一个强大而性能良好的片段筛选平台。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Bothe S/ et al. Fragment screening using biolayer interferometry reveals ligands targeting the SHP-motif binding site of the AAA+ ATPase p97. Commun Chem. 2022 Dec 7;5(1):169. 9. 天然化合物库筛选 天然产物一直是治疗许多疾病（包括传染病）的重要药物资源。它们的特点是包括组成的多样性和结构的复杂性，可以作为候选药物的储备库。来自澳门科技大学的研究人员利用分子对接并结合 BLI  技术从 1871 个化合物库中发现针对 SARS-CoV-2 RBD  的天然小分子抑制剂。一些天然化合物抑制 SARS-CoV-2 诱导的 Vero E6  细胞的病变效应和斑块形成，使其丧失明显的动物毒性并具有 SARS-CoV-2假病毒突变体（D614G、N501Y、N439K 和 Y453F）的抗病毒效果。 研究人员首先通过分子对接技术对 1871 个化合物进行筛选，然后选择了分子对接评估结果低于 -7.0 kcal/mol 的 540 个化合物，通过 BLI 检测其与 Spike-RBD 蛋白的亲和力。将RBD 生物素化后固定在 SSA 探针上，与 2 倍梯度稀释的浓度范围为 200-1.56 μM 的小分子抑制剂进行反应，BLI 筛选后，其中 14 个化合物与 Spike-RBD 表现出高亲和力结合（图1）。除此之外，发现一些亲和力较高的天然产物，比如EGCG、Bkc 和 Ibvc 还与 ACE2 受体结合，体现与 RBD 和ACE2 双重结合，研究人员进一步使用 BLI 技术进行小分子之间的竞争实验（图 2），对小分子在蛋白靶点上的结合位点进行分组，红色代表竞争，绿色代表不竞争（图 3）。 本文采用 Octet® 从大量天然化合物中快速高效地筛选出 4 种小分子抑制剂，同时利用 Octet® 进行了竞争实验，通过高通量表位分析软件对不同的结合位点进行了分组，综合体外和体内数据，认为 EGCG  是最具合适候选药物，具有更好的药物疗效和安全性。此研究为大家解析了如何利用 Octet®   从天然化合物库进行药物筛选的典型流程，Octet®可以快速开发实验方法，优化实验条件，更快的进行化合物筛选；小分子研究中，几乎很难避免使用 DMSO 等有机溶剂， Octet® 对 DMSO 等有机溶剂极端不敏感，非常适合小分子化合物筛选。 图1 图2 图3 参考文献（点击下方文献阅读原文） Zhang D/ et al. Identification of natural compounds as SARS-CoV-2 entry inhibitors by molecular docking-based virtual screening with bio-layer interferometry. Pharmacol Res. 2021 Oct;172:105820. 10. SpCas9 小分子抑制剂发现 许多基因工程技术的实施都需要依赖准确地对 CRISPR-Cas9  系统进行有效的控制从而保证基因编辑的准确有效。SpCas9 作为一种基因治疗手段，已经被用于包括 HIV，肌肉萎缩症，视觉和遗传性错乱等基因治疗中。由于不断高发的脱靶效应、染色体易位、基因毒性等副作用，对治疗手段尤其是 SpCas9 的治疗剂量和时空的调控显得十分的重要。 来自麻省理工学院与哈佛大学布罗德研究所的研究团队通过一系列生化和细胞水平的测定，筛选出针对 SpCas9  的小分子抑制剂，使得对于CRISPR-Cas9 基因编辑系统有了更加行之有效的控制。这些小分子抑制剂的作用方式有两种：抑制 SpCas9 与 DNA 的结合和抑制 SpCas9 切割DNA 的能力。 Cas9 与单个 PAM 序列的亲和力比较弱，不足以建立 FP（荧光偏振）初级筛选方法。所以作者构建了 8 个 PAM 重复序列，通过亲合作用提高亲和力。Octet®  的结果也证明了 SpCas9 与含更多 PAM 位点的 DNA 序列结合能力更强。 随后研究人员构建了基于 FP 的小分子初级筛选方法，文中也提到一些化合物的结合会猝灭 DNA 标记的荧光信号导致 FP的假阳性。所以在筛选到 RBD0539 小分子抑制剂（苗头化合物）后，随即验证 BRD0539 与 SpCas9 的亲和力 KD=0.7μM，且重复性非常好。 最重要的是，这些小分子抑制剂可以稳定地进入细胞，且比过往研究的一些 CRISPR  蛋白抑制剂 (  例如AcrIIA4， BLI 验证其竞争 DNA 结合 ) 要小的多。应用这样的新型化合物抑制剂能够对 SpCas9  进行可逆，剂量可控，相对稳定且温和的控制。这样的“抗 CRISPR 蛋白”抑制剂的发现，对应用于哺乳动物细胞的基因编辑，碱基编辑，和表观遗传编辑具有重要意义。 图 1. 用 Octet®  检测 N 个 PAM 重复序列与 SpCas9 的亲和力 图 2. 左图为 Octet® 亲和力检测，右图为两次稳态拟合重复结果对比 总结：这项研究旨在快速识别和筛选针对 SpCas9 和新一代 CRISPR 相关核酸酶的小分子抑制剂。BLI 技术为非标记技术，在小分子检测方面具有灵敏度高、准确、高通量、耐有机溶剂、假阳性低等优势，能够快速筛选与 Cas9 结合的潜在小分子抑制剂，并有效验证其效力，因此被研究人员用于最终的亲和力结果确认。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Maji B/ et al. A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9. Cell. 2019 May 2;177(4):1067-1079.e19. 11. 极限小分子检测 全球抗真菌耐药性的出现对现有的治疗策略和人类健康造成了极大威胁，靶向真菌致病功能是一种具有潜力的替代治疗策略。2022 年 12 月 16 日，山东大学娄红祥及常文强发表在 Science Advances  结果表明与胱氨酸γ-  裂解酶相比，胱氨酸β- 合成酶 (CBS) 是致病真菌白色念珠菌中合成硫化氢的主要酶。CBS 缺失导致抗氧化应激能力不足，细胞生长迟缓，菌丝生长缺陷，β- 葡聚糖暴露增加，这些共同降低了白色念珠菌的致病性。 研究人员通过高通量筛选，确定了一种从地衣中获得的天然分子原酯酸 (Proteichesterinic Acid，PA)  可作为 CBS的抑制剂，并且在体外采用 Octet®   系统测试了 PA  与CBS 能够有效的结合，亲和力为 110μM。PA 能够中和白色念珠菌的毒力，并在小鼠念珠菌病模型中表现出治疗效果。这些发现证明了 CBS  作为抗真菌感染的潜在治疗靶点的可行性。 在小分子药物开发过程，例如片段化合物的筛选，可能会涉及到检测分子量极端小的分子，对检测方法的灵敏度要求极其高，本研究中检测的氨基氧乙酸 AOA 仅有 91Da，通过 Octet®  依然可以灵敏的检测出准确的结果，同时对溶剂不敏感，无流路的设计，可以更好的应对小分子检测过程中各种复杂的情况。 真菌 CBS 抑制剂对酶活性的影响 参考文献（点击下方文献阅读原文） Chang W/ et al. Inhibition  of fungal pathogenicity by targeting the H2S-synthesizing enzyme cystathionine β-synthase. Sci Adv. 2022 Dec 16;8(50):eadd5366. 12. PROTAC 小分子验证 乳腺癌 (BC)  是世界上和女性中最常见的癌症之一，其中三阴性的乳腺癌（TNBC）在乳腺癌中最为棘手。细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK  是 TNBC 治疗的潜在治疗靶点。以往针对 CDK  的靶向药最终会产生耐药抗性，蛋白降解靶向嵌合体 PROTAC  可以定向降解靶蛋白， PROTAC 可以提高蛋白质降解的选择性并逃避耐药机制。 暨南大学丁克团队从 CDK12/13 高亲和力抑制剂 Compound 3  出发，通过计算模拟的方法改造了 Compound 3  暴露的侧链形成 Compound 4  用于 PROTAC  分子改造（图 1），且通过 BLI 技术验证了改造不影响其与 CDK12/13 的结合（图 2）。在 Compound 4  的基础上筛选合适的 linker  与 thalidomide 偶联获得的 7f，获得了全球首个靶向 CDK12/13的 PROTAC  降解剂，在 MDA-MB-231  乳腺癌细胞中有效降解 CDK12 和 CDK13，DC50 值分别为 2.2 和 2.1 nM。 图 1. 研究人员同时采用了 Incucyte® 实时活细胞分析系统实时地监测细胞的生长状态，软件可以自动分析得到细胞汇合度或细胞数指标，并自动绘制生长曲线，用来追踪细胞的生长变化趋势，发现该 PROTAC 对MFM223 和 MDA-MB-231 肿瘤细胞具有很强的抗肿瘤活性。 图 2. 在小分子药物设计优化过程中，需要针对小分子的结合活性、水溶性、特异性等进行修饰与改造，而结合活性又是其中关键指标，通过 BLI 技术可以实现高灵敏度准确的结合活性分析，且单个生物传感器的成本低，在成本极低的条件下即可完成构效分析以及靶点选择性分析。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Yang J/ et al. Discovery of a Highly Potent and Selective Dual PROTAC Degrader of CDK12 and CDK13. J Med Chem. 2022 Aug 25;65(16):11066-11083. 13. PROTAC 药物与靶点蛋白复合物研究 PROTAC 是一种异双功能分子，一端是结合靶蛋白的配体，一端是泛素化连接酶的配体，中间通过合适的 Linker 相连。 PROTAC 分子结合靶蛋白（POI）和 E3 连接酶，形成三元复合物，给靶蛋白打上泛素化的标签，泛素化的蛋白被细胞内的蛋白酶体 26S 识别并降解。PROTAC 作用机制的关键是在靶点、降解剂和 E3 连接酶之间形成三元复合物，以促进泛素化和随后的降解。目前对于 POI-PROTAC-E3  三元 复 合 物 结 构 的 认 识 有 限，辉 瑞 公 司 设 计 了 基 于BTK-cIAP1 的新型 PROTAC 分子，并结合生化、生物物理和结构学研究对 PROTAC 介导的三元复合物进行表征。研究人员采用了更刚性的 linker，改变了其与蛋白的结合动力学和降解能力，与计算模型和第二、三元复杂晶体结构的预测一致。这些数据为 E3 连接酶的 IAP 家族靶向蛋白降解机制提供了新的见解。 研究人员利用 Octet® 检测了三元复合物形成。将 biotin-cIAP1偶联到 SA 传感器上，先浸入含 BC5P（PROTAC）的溶液中。经过简短的清洗后，将 cIAPI+BC5P  二元复合物浸入含有BTK 激酶结构域的溶液中，分析其结合速率常数（kon）和解离速率常数（koff)（下图 a）。可以看到 Binary Kd（BC5P直接与 BTK  结合）= 259 ± 31 nM < Ternary Kd（cIAPI  固化BC5P，再与 BTK 结合）= 474 ± 40 nM，说明了三元复合物系统是非协同的（下图 b 和 c）。 Octet®  可以轻松实现多分子连续结合的动力学检测，所以在 PROTAC 开发过程中，研究人员可以通过 Octet®  快速筛选 PROTAC 分子、不同的 linker 和小分子的组合，准确表征 PROTAC 跟靶点蛋白的结合活性。PROTAC 介导的蛋白降解是泛素化连接酶依赖的，而 POI-PROTAC-E3  三元复合物的形成是靶蛋白被成功降解的前提，研究人员通过 Octet® 可以快速、准确、直观的获得三元复合物形成的结果。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Schiemer J,et al. Snapshots and ensembles of BTK and cIAP1 protein degrader ternary complexes. Nat Chem Biol. 2021 Feb;17(2):152-160. 14. 先导化合物的验证和表征 Bromodomains（BRDs）是一类能够特异性识别乙酰化赖氨酸残基的保守蛋白结构域，存在于染色质及与转录相关的蛋白中，在细胞内由乙酰化介导的蛋白 - 蛋白相互作用中发挥极为重要的作用，是多种疾病（包括癌症、炎症和自身免疫疾病）的表观遗传医学靶点。包含 BRDs 的 BAZ2A和 BAZ2B 蛋白是核仁重塑复合体（NoRC）的中心支架蛋白，而 NoRC 在调节非编码 RNA 的表达和抑制异染色质的形成方面发挥了作用。 目前，BRDs 已经成为重要的药物作用靶点，已有众多针对BRDs 蛋白为靶点的小分子抑制剂成功开发，但 BAZ2 特异性的抑制剂还未见报道。 在本篇文章中，研究人员通过其他技术筛选得到了先导化合物，通过对侧链的修饰得到了 BAZ2  的特异性抑制剂GSK2801，并且 GSK2801 具有很好的特异性。通过生物层干涉技术进一步验证了 GSK2801 与 BAZ2B 的结合，亲和力为 60nM（下图 a），与 ITC 结果一致，但 BLI 技术可以实时监测分子间的相互作用的整个过程，GSK2801与BAZ2B   的 结 合 呈 现 快 结 合 与 快 解 离 的 结 合 模 式 IE (Kon1.57±0.02X105 M-1S-1; Koff6.95±0.058 X10-3S-l)。 BLI 技术通过对候选物的亲和力以及解离动力学数据进行甄选，有效地避免了在研发后期因不理想的结合表征数据而导致的项目失败。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Chen P/ et al. Discovery and Characterization of GSK2801/ a Selective Chemical Probe forthe Bromodomains BAZ2A and BAZ2B. J Med Chem. 2016 Feb 25;59(4):1410-24. 15. 高通量虚拟筛选化合物筛选与验证 激活素属于TGF-β 超家族的一员，与多种疾病相关，包括癌症、早产、骨质疏松等。靶向激活素及其相关的信号通路中的蛋白有望作为治疗这些疾病的治疗手段。先前的研究显示阻断激活素的信号通路，可逆转多种疾病的发展，但目前并没有有效的激活素的拮抗剂具有足够高特异性用于临床上治疗激活素信号通路介导的疾病。研究人员通过激活素晶体结构筛选用于特异性破坏配体/ 受体相互作用和激活素信号传导的小分子结合口袋。再通过计算机模拟 ZINC 数据库虚拟筛选了 1800 万的化合物，综合考虑最终筛选得到 39 种化合物。研究人员继续通过 FSHβ 转录、HepG2 细胞凋亡、抑制卵巢细胞体外增殖和卵巢切除小鼠中激活素刺激的 FSH的拮抗功能分析，筛选得到两种先导化合物：NUCC-47 和NUC-55，体内实验显示 NUC-C55 是最有效的化合物，导致卵巢切除小鼠 FSH 水平的剂量依赖性降低。 研究人员利用 BLI 技术分析了 NUCC-555 对激活素和其配体结合的影响，竞争结果显示 NUCC-555 可竞争激活素和其配体的结合，研究人员将激活素配体 ALK4-ECD-Fc 固化至 ProA 传感器上，计算 NUCC-555 对激活素与ALK4-ECD-Fc 竞争影响，如图（图 1）所示随着 NUCC-555 的浓度提高，由于 NUCC-555 与 ALK4-ECD-Fc 竞争结合激活素导致激活素与 ALK4-ECD-Fc 结合信号降低。由此证明 NUCC-555 是选择性的竞争抑制激活素和其配体的结合，而不抑制肌骨素与其配体的结合（图 2）。 图1 图2 参考文献（点击下方文献阅读原文） Zhu J, et al. Virtual High-Throughput Screening To Identify Novel Activin Antagonists. J Med Chem. 2015 Jul 23;58(14):5637-48. 16. 小分子设计及优化改造 细胞内蛋白质的降解通过泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）来控制，对细胞内蛋白质的稳态至关重要。Cullin RING 连接酶（CRLs）是 UPS 的核心成分，调节约 20% 的细胞蛋白质周转，在正常细胞生理和各种人类疾病中发挥着关键作用。 DCN1（defective in cullin neddylation 1）是 co-E3 连接酶，通过两个结构域分别与 UBC12 和 cullin 1 相互作用，CRL 泛素连接酶拟素化修饰（Neddylation）通过 DCN1 与 UCB12相互作用进行动态调控。研究人员对 DCN1 与 UBC12 复合物的晶体结构分析发现 DCN1–UBC12  的相互作用很适合于设计小分子抑制剂。因此，研究人员基于 DCN1-UBC1 的晶体结构信息设计合成一系列化合物，通过分子对接及多轮化合物优化等实验找到了具有细胞膜穿透性的 DCN1  抑制剂 DI-591。 图1. 基于结构的药物设计思路 图 2. 基于结构设计的 DCN1-UBC12 相互作用抑制剂 通过Octet®检测，DCN1与DI-591亲和力达到31nM[1] 。随后，他们在 DI-591 的基础上改造获得了 DI-1548，作为 DCN1的一种共价抑制剂。性抑制细胞中 cullin 3DI-1548的 Neddylation在低纳摩尔浓度下就可以选择，并且比可逆 DCN1抑制剂 DI-591 的效力高 2-3 个数量级[2]。Octet®亲和力检测结果与荧光偏振一致。另外研究人员发现选择性抑制cullin3有效的，证明了选择性抑制在保护小鼠免受对乙酰氨基酚诱导的肝损伤方面是cullin neddylation 的治疗潜力！ 图 3. BLI 技术检测 DCN1 与 DI-591 亲和力以及活性分析：d 图，e 图左边为结合解离结果，右边为稳态拟合结果；C 图为荧光偏振结果 图 4. Octet®  检测 DCN1 与共价化合物 DI-1548 结合无解离 采用基于 BLI  技术的 Octet®   非标记分子互作系统来检测候选化合物的亲和力是研究人员在药物研发过程中非常重要的一环，其表征结果可以对传统方法做很好的补充验证，其易用性也可以帮助研究人员加快药物研发进度，缩短周期，节约成本。在小分子药物筛选及修饰改造研究中，常常会涉及到分子相互作用检测。通过 BLI  技术进行分子互作检测可以获得亲和力、结合和解离速率常数，得到定量结果。传统方法多数需要标记，可能会改变靶点分子构象导致假阳性结果。BLI 是非标记实时检测技术，可以克服传统方法的弊端，且对有机溶剂不敏感，使得小分子相互作用检测结果更加真实可靠！在研究共价化合物的结合过程中，传感器的再生是一个很大的挑战，而 Octet®    的传感器单个成本低，可以在共价化合物的检测过程中大放光彩。 采用基于 BLI 技术的 Octet®  非标记分子互作系统来检测候选化合物的亲和力是研究人员在药物研发过程中非常重要的一环，其表征结果可以对传统方法做很好的补充验证，其易用性也可以帮助研究人员加快药物研发进度，缩短周期，节约成本。在小分子药物筛选及修饰改造研究中，常常会涉及到分子相互作用检测。通过 BLI 技术进行分子互作检测可以获得亲和力、结合和解离速率常数，得到定量结果。传统方法多数需要标记，可能会改变靶点分子构象导致假阳性结果。BLI 是非标记实时检测技术，可以克服传统方法的弊端，且对有机溶剂不敏感，使得小分子相互作用检测结果更加真实可靠！在研究共价化合物的结合过程中，传感器的再生是一个很大的挑战，而 Octet®    的传感器单个成本低，可以在共价化合物的检测过程中大放光彩。 参考文献（点击下方文献阅读原文） [1] Zhou H/ et al. A potent small-molecule inhibitor of the DCN1-UBC12 interaction that selectively blocks cullin 3 neddylation. Nat Commun. 2017 Oct 27;8(1):1150. [2] Zhou H/ et al. Selective inhibition of cullin 3 neddylation through covalent targeting DCN1 protects mice from acetaminophen-induced liver toxicity. Nat Commun. 2021 May 11;12(1):2621. 17. 小分子环肽抑制剂开发 人类 GTP 酶家族代表了一个巨大但在很大程度上尚未开发的药理靶标来源。Gαs 作为一种 GTPase，通过将 GTP 水解为 GDP 来实现活性（GTP 结合）和非活性（GDP 结合）状态之间的构象 ( 核苷酸态 ) 变化。Gαs 与细胞内高浓度GTP 的高亲和力、以及 Gαs 与上下游蛋白相互作用界面过于平坦导致了 Gαs 的不可成药性。由于线性肽细胞通透性差且在细胞中不稳定，不能作为药物发现的理想分子。环肽具备环化的稳定序列及构象，以此获得更好的细胞渗透性和稳定性，同时能够靶向蛋白质 -  蛋白质界面。因此，环肽是 Gαs 蛋白药物开发的有希望的候选者。研究人员开发了随机非标准肽集成发现 RaPID 系统，从 1012  的库中先后靶向两种不同核苷酸态的 Gαs 筛选得到了两种高亲和力的大环肽，GN13 和 GD20。它们分别拮抗 Gαs 的活性和非活性状态。由于环肽分子量小、亲和力范围跨度大、筛选样品本量大、部分多肽需要使用有机溶剂助溶等因素，为了克服上述问题，研究人员采用了 Octet 检测环肽和 G αs 蛋白的亲和力。两环肽都可微调 Gαs 活性，具有高核苷酸结合状态选择性和 G 蛋白类特异性。靶向 Gαs 的环肽抑制剂的发现为进一步开发状态依赖性 GTPase 抑制剂提供了途径。 图 1. 构象选择性 Gαs 抑制剂的筛选策略 图 2. Octet® 测定两种环肽结合不同状态下的 Gαs 蛋白能力：左边为环肽 GN13 结合活性状态下的 Gαs 蛋白（Gαs/GNP）， KD 值为 0.19 ± 0.02 mM；右侧为环肽 GD20 结合非活性状态下的 Gαs 蛋白（Gαs/GDP），KD 值为 31.4 ± 0.7 nM 17. 小分子环肽抑制剂开发 图 3. Octet® 检测环肽靶向 G 蛋白类的特异性：两种多肽只与相应核苷酸态的 Gαs 结合 在本研究中，研究人员阐明了大环肽与 Gαs 蛋白结合的结构基础，也揭示了两种大环肽对于 G 蛋白选择性的分子识别基础。预计未来这种大环肽可能在 Gαs 突变致病的相关疾病中的治疗中具有较好潜力，并且在探索 Gαs 介导的信号转导机制的研究中作为化学探针使用。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Dai SA/ et al. State-selective modulation of heterotrimeric Gαs signaling with macrocyclic peptides. Cell. 2022 Oct 13;185(21):3950-3965.e25. 18. 细胞与分子互作 研究人员第一次成功的将活细胞固化在传感器上，并检测到细胞和其他分子间的相互作用。文中采用将胶原蛋白固化在AR2G 传感器上，然后再将A431 鳞状细胞癌细胞固化在胶原蛋白上，固化完毕后，用显微镜观察传感器表面的固化情况（图 1）。用 BLI 技术检测表达在细胞表面的 EGFR 受体与 EGF 的反应。结合信号随着浓度的增加而增加，有明显的剂量依赖效应（图 2）。通过分析获得的亲和力值为 2.2nM 左右，与报道值一致。 文中还尝试了小分子化合物（dopamine）、拮抗剂竞争以及抗体药物筛选等多项实验，均获取了理想的结果。作者还对信号产生的原理进行了阐述，认为是由动态质量再分配（Dynamic mass redistribution）效应引起了光干涉信号的变化。 图 1. 固化 A431 细胞的传感器的显微镜观察结果 图 2. A431  细胞（EGFR  高表达）与 EGF  的结合 参考文献（点击下方文献阅读原文） Verzijl/ D/ et al. "A novel label-free cell-based assay technology using biolayer interferometry. " Biosensors & Bioelectronics (2017):388-395. 19. 定量方法开发 治疗药物监测被认为是最大限度提高疗效的有力工具。卡马西平 (CBZ)  是一种主要用于治疗癫痫和神经性疼痛的抗惊厥药物。直接实现现场从癫痫患者的全血中高通量、快速、灵敏、准确的检测卡马西平含量，是当前的临床实践中是迫切需要解决的问题。然而目前的检测方法都存在一定的局限性。Octet® 在样品检测中具有基质受耐性好、高通量、快速、灵敏度和准确性高等优势，因此西湖大学的研究人员利用 Octet®  开发了两种类型的生物传感器（间接法与直接法）用于 CBZ 监测。 图 1. 生物层干涉技术原理和检测卡马西平 (CBZ) 的步骤 图 2. 间接法的 BLI 生物传感器：将样品与针对 CBZ 的单克隆抗体（MA-CBZ）预孵育，混合物与固化的 CBZ 竞争以结合 MA-CBZ；CBZ 浓度越高，MA-CBA 信号越低 19. 定量方法开发 图 3. 直接法 BLI 生物传感器：使用样品 CBZ 和 CBZ- 辣根过氧化物酶（CBZ-HRP）偶联物直接竞争与固化的MA-CBZ 结合，然后二氨基联苯胺（DAB）放大信号；CBZ 浓度越高，DAB 信号越低 间接法 BLI  检测 CBZ  在治疗范围内，且再生高达 12  次，可在 25 分钟内报告结果。然而，直接法 BLI 检测 CBZ 时间约 7.5 min，检测浓度低至 10 ng/mL，具有良好的准确性、特异性和灵敏度。来自癫痫患者的六对血清和全血的直接法 BLI  检测结果与超高效液相色谱法的一致性极佳。由于自动化并能够实现高通量，直接法 BLI  可以在几分钟内从患者全血中准确且高灵敏的检测 CBZ 值，使其成为临床实践中 CBZ 现场监测的有效和合适的工具。 图 4. 6 位癫痫患者全血间接法 BLI 和直接法 BLI 检测结果与 UPLC 结果，结果显示，两种方法一致性非常好。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Bian S/ et al. On-Site Biolayer Interferometry-Based Biosensing of Carbamazepine in Whole Blood of Epileptic Patients. Biosensors (Basel). 2021 Dec 15;11 (12):516. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是禾本科镰刀菌和黑穗病菌的次级代谢产物。在全球范围内，DON  的残留可以发生在诸如小麦、大麦和玉米等各种谷物中。为了保护人类和动物的健康，许多国家都建立了 DON 在谷物中限量的法规。在美国，人类食用的粮食中，DON 残留量不得超过 1 mg/kg(1ppm)。 本文基于生物层干涉技术（BLI）的竞争法建立了在粗样品中进行小分子毒素的浓度测定方法。 实验步骤：  ●将偶联了 DON 的 BSA 固化在 APS 传感器上   ●用酪蛋白封闭 ●将传感器孵育在 DON 抗体与含有 DON 面粉粗提物的混合液中   ●用甘氨酸缓冲液再生传感器，将抗体从传感器上洗下来 BLI 检测灵敏度可以达到 0.1 mg/kg；使用再生后的传感器，在0.2 - 5 mg/kg 范围内，平均回收率可以达到 101.4 %，RSD 为13.2 %。并且传感器可以再生使用多次。检测 8 个样品的时间在10 分钟左右。 用 BLI 技术对脱氧雪烯醇检测示意图 DON 标准曲线 本文证明 BLI 技术可以用于粗样品的精确检测，而且成本低，速度快。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Chris M. Maragos . Detection of deoxynivalenol using biolayer interferometry. Mycotox Res (2011) 27:157-165 20. 小分子核酸适配体（Aptamer）研究 BLI 技术适用于适配子与靶点的亲和力验证。用链霉亲和素传感器固化生物素化适配子，检测 GTX（膝沟藻毒素）的亲和力。而该适配子与其他类型的贝类毒素（STX,GTX2/3）不反应或者反应非常弱。 BLI 技术还可以实现对毒素的浓度测定。用固化适配子的传感器，检测不同浓度的 GTX1/4。左图可见，浓度与信号曲线在 0.2 ng - 90 ng/mL 范围内呈现良好的线性关系 [1]。 BLI 技术也可以用竞争法和信号放大的方式建立基于适配子的毒素高灵敏度检测方法。 先将海葵毒素 [2]   PTX 固化在氨基偶联传感器（AR2G）上，然后将传感器与 HRP （辣根过氧化物酶）偶联的适配子和含有PTX 的样品的混合物孵育，然后用 HRP 的底物 DAB 进行信号放大。如果 PTX  的混入浓度越高，检测的信号越低。整个实验只要 10 分钟就可以完成。检测极限为 0.04 pg/mL。 GTX1/4 与适配子的亲和力为 Kon(1/Ms)=6.43E+04 Kdis(1/s)=1.14E-03 Kd (M)= 1.77E-08 不同浓度的 GTX 结合信号             GTX 浓度标准曲线 信号放大法示意图 信号放大后 PTX 浓度依赖信号 将 PTX 加入到不同贝类的提取物中进行检测，已知浓度为 50,200,800pg/mL，然后将计算的浓度与已知浓度进行比 较 获 得 回 收 率，每 个 实 验 重 复 三 次。回 收 率 在100.27%–108.24% 之间，说明贝类海鲜的提取物基质对检测没有明显影响。变异系数在 2.27%–6.76% 之间，说明该方法的重复性非常好。 参考文献（点击下方文献阅读原文） [1]Gao S/ et al. Gonyautoxin 1/4 aptamers with high-affinity and high-specificity: From efficient selection to aptasensor application. Biosens Bioelectron. 2016 May 15;79:938-44. [2]Gao S/ et al. Enzyme-linked/ aptamer-based/ competitive biolayer interferome- try biosensor for palytoxin. Biosens Bioelectron. 2017 Mar 15;89(Pt 2):952-958. 21. 非标记方法亲和力检测结果对比 HIV 衣壳蛋白 (CA) 是抗病毒药物设计的重要靶点。高通量筛选结果已经确定了两类化合物 (PF74 和 BI64) 直接靶向HIV 衣壳，从而对 HIV-1 和 HIV-2 实验室株具有抗病毒活性。小分子药物与靶点的结合活性分析是药物体外评价非常重要的一环，因此选择一个高通量、灵敏、准确、不受干扰的方法对药物体外活性评价显得更加重要。之前 CA  的聚合分析主要采用荧光标记或者吸光度的检测方法，该类方法极易受到化合物和缓冲液组成的干扰。因此，吉利德团队开发了生物层干涉法 (BLI) 、表面等离子体共振 (SPR)和等温滴定量热法 (ITC)  三种非标记分析技术用于药物与靶点亲和力检测。在研究中，虽然 BLI 与 SPR 都是通过动力学方式进行检测，但文章中研究人员评价 BLI  采用无流路设计，可以更好的耐受不同样品组成以及不同类型的小分子。亲和力检测结果揭示了 PF74 和 BI64 如何调节衣壳蛋白活性，从而产生抗病毒活性。 PF74 优先结合预组装的六聚体衣壳形式，并通过稳定衣壳亚基间相互作用来防止高阶衣壳结构的破坏。BI64 仅结合单体衣壳，并通过破坏衣壳间亚基相互作用将蛋白质锁定在不具备组装能力的单体形式。这些非标记分析结果表明在相同样品和缓冲体系下，SPR 与 ITC 和 BLI 的结果具有可比性，BLI 与 ITC 的结果更加一致，为鉴定不同类型的衣壳功能小分子调节剂提供了可靠的方法。 图 1. 通过 SPR、BLI 和 ITC 分析 PF74 和 BI64 与单体 CA 和六聚体 CA 的结合，BLI 与 SPR 结果几乎一致。 由于化合物溶解度有限，BI64 与 CA 六聚体结合的 KD>10 μM (SPR) 和 >30 μM (BLI)，这是所测试化合物的最高浓度。 BLI 技术对溶剂更不敏感，因此可以使用更高浓度的溶剂使小分子化合物浓度范围更大。 本研究的结果显示，BLI 技术采用无流路设计，在小分子药物开发中，具有更高通量，耐受有机溶剂，灵敏度高，结果准确等优势，在小分子药物开发中具有更广阔的应用前景。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Lad L/ et al. Functional label-free assays for characterizing the in vitro mechanism of action of small molecule modulators of capsid assembly. Biochemistry. 2015 Apr 7;54(13):2240-8. 22. 实验条件优化 TRF2 是端粒相关蛋白，在端粒维持中起重要作用。敲低TRF2 可引起染色体端到端融合并诱导 DNA 损伤反应。鉴定能够结合 TRF2 的 TRFH 结构域并阻断 TRF2 与其相关蛋白相互作用的小分子化合物对于阐明这些蛋白 -  蛋白相互作用的分子机制具有重要意义。 开发稳定且灵敏的筛选和表征方法是小分子抑制剂开发中非常重要的一环。中国药科大学团队通过三步优化，验证了优化后的 BLI( 生物层干涉法 ) 方法是一种准确、可重复的 TRF2  抑制剂筛选和表征方法。这种可靠的非标记 BLI检测可以作为正交确认试验，用于验证从其他试验中获得的结果，减少小分子检测假阳性或者假阴性的结果。 1. 固化蛋白浓度 经测试，后续实验均采用 10 μg/mL 的生物素化 TRF 蛋白样品和 20 min 的固化时间，以达到高信噪比、最小非特异性相互作用、可行的测定时间和蛋白质消耗之间的最佳平衡效果。 2.BSA，吐温 20 浓度 TRF2-27  已通过荧光偏振技术（FP）验证其亲和力，可作为优化实验的工具分子。经测试，0.01 %BSA 及 0.01 % 吐温 20  可为后续实验减少非特异性结合并提供稳定的固化高度和较高的稳定的信号窗口。计算所得 Kd 与 FP 检测得到的 Ki=4.2 uM 具有可比性。 图 1 A. 四个浓度 BSA 溶液中，含有 BSA 的样品溶液信号相对稳定，0.01 %BSA 中的 Rmax 最高（0.219 nm）。在 BLI 小分子筛选时，由于信号高度与分子质量直接相关，提高 Rmax 可以提供更大的检测信号窗口。此外，在再生后的第二次循环中，含 BSA 组 Rmax 变化 <20 %，提高了固化表面蛋白稳定性。 B. 四个浓度吐温 20 溶液中，信号随着吐温浓度升高依次减弱，再生前后的差异在 0.01 % 吐温中最小。吐温的存在可减少非特异结合信号，降低噪音。 3.DMSO 浓度 在 1-10 %DMSO 溶液中，BLI 能维持较高的数据质量（R2>0.95，X2<0.1，Kd 的 SD<30 %）。且所有的数据结果与之前的检测结果一致，由此可知 BLI 在 DMSO 浓度下不需要额外的 DMSO 校准步骤，即可获得高质量的数据。 综上所述，低日常成本等独特优势。更重要的是，对BLI 技术可为小分子动力学检测提供可靠，稳定的结果。与其他动力学检测技术相比，具有低维护负担和DMSO 的特殊耐受性和蛋白质表面的稳定性，使得可靠的生物传感器再生 能够降低分析成本，并且提供更高通量的仪器，适合于小分子和片段的文库筛选的高通量筛选。 参考文献（点击下方文献阅读原文） Guo T, et al. Development and optimization of a cascade of screening assays for inhibitors of TRF2. Anal Biochem. 2020 Aug 1;602:113796. 联系我们 📍邮箱 🍃 zhengbing@yiqi.com 📍服务热线 🍃 13816953977