Live attenuated mumps vaccine(Chinese Academy of Medical Sciences)

病毒的生长和复制需要依存于活体生物或者是生物的组织与细胞；用于体外培养病毒的细胞统称为细胞基质（cell matrix）。细胞培养是指离体的细胞在特定的条件下在体外进行生长、分裂繁殖的过程。目前，可以用于疫苗等生物制品的细胞基质有多种细胞，例如各种动物的原代细胞、二倍体细胞、传代细胞。根据细胞生长的模式和要求又可以划分为两种细胞生长类型，即贴壁依赖细胞（anchorage-dependent）和非贴壁依赖细胞（anchorage- independent）。贴壁依赖细胞：需要黏着或依附在一定的载体上才能良好生长繁殖，单一游离细胞不能良好生长繁殖，典型的代表是单层细胞培养。非贴壁依赖细胞：单一游离细胞就能够良好生长繁殖，体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长，及时传代后，细胞的生长繁殖得以继续。二倍体细胞是贴壁依赖、接触抑制生长的，有些细胞则是贴壁依赖、接触促进生长的，可以快速形成致密单层，甚至是多层。细胞类型及来源用于制造病毒性疫苗的细胞类型有原代细胞、二倍体细胞、传代细胞。研究人员可以根据实际需要和自身的条件选取某一类型的细胞开展疫苗的研究开发工作条件选取某一类型的细胞开展疫苗的研究开发工作。一动物的原代细胞将新鲜动物组织剪碎、消化、分散后，在适当条件下进行培养的细胞称为原代细胞，它们不能进行多代次的长期无限的培养，经过一定代次培养后，该细胞再也不能生长繁殖，直到衰老死亡和凋亡。一般将动物组织消化培养的第一代细胞称为原代细胞，第二代细胞称为次代细胞，如此类推。1细胞类型根据不同动物组织来源，有地鼠肾细胞、沙鼠肾细胞、牛肾细胞、鸡胚成纤维细胞等。2特点如果来源于无特定病原体（SPF）动物，细胞受外源因子污染的概率较低，一般不存在致癌基因和致癌蛋白，故致肿瘤源性的可能性极低。3应用可用于减毒活疫苗和灭活疫苗生产。迄今为止，在我国已经批准生产的疫苗如下：地鼠肾细胞可用于狂犬病疫苗、乙型脑炎疫苗生产；沙鼠肾细胞可用于流行性出血热疫苗生产；牛肾细胞可用于轮状病毒减毒活疫苗；鸡胚成纤维细胞可用于麻疹减毒活疫苗、流行性腮腺炎减毒活疫苗、狂犬病灭活疫苗等；狗肾细胞和兔肾细胞曾用于风疹减毒活疫苗生产。二二倍体细胞二倍体细胞是指那些能够在一定细胞周期即一定代次范围内进行有限传代培养的细胞系；一般情况下最多只能传代培养50～100代。因为它们的细胞核的染色体在一定代次数内仍然是二倍数的，故而得名二倍体细胞。而且，它们的细胞结构仍然与来源生物供体的细胞有一致性。在正常情况下，它们的生命周期有限，因此，它是一种半传代细胞。1细胞类型二倍体细胞又可以分为人类二倍体细胞和动物二倍体细胞。人二倍体细胞（HDCs）是指那些来源于正常人体组织并且能在体外进行培养的细胞。一般来源于人类胚胎的肺、肾等组织，其染色体数目与原供体细胞染色体相同或基本相同，2n细胞占80%以上。目前全球用于疫苗生产制备的二倍体细胞有几个细胞株，在国外建立并且得到批准用于疫苗生产的二倍体细胞有人类二倍体细胞WI- 38、MRC- 5、猕猴胚胎肺二倍体细胞FRhL- 2。我国人二倍体细胞有2BS和KMB17。2特点二倍体细胞虽然比其他传代细胞具有更佳的安全性，许多疫苗都以二倍体细胞培养的疫苗作为金标准。但是，由于它们分裂生长速度慢，对于某些病毒不甚敏感，对某些病毒的培养感染滴度或产量明显低于其他细胞。例如，MRC- 5细胞培养流感病毒冷适应株A/Ann/Arbor/6/60的产量就比用原代鸡肾细胞和原代鸡胚肾细胞培养低100倍。另外，一般认为，二倍体细胞难以适应柱型搅拌式生物反应器培养。3应用可用于减毒活疫苗和灭活疫苗生产。在国外使用的人二倍体细胞系有MRC- 5、WI- 38细胞。在国内建立并且得到批准用于疫苗生产的二倍体细胞有2BS、KMB17细胞。下面详细介绍一下这几种细胞， 分国外和国内两大类介绍。（1）国外的人二倍体细胞系1）WI- 38人二倍体细胞系WI- 38细胞由美国Wistar研究所（Wistar institute）的L. Hayflick和他的同事所建立的，故名为WI-38，是世界上第一个建株的正常人二倍体细胞，也是首株用于人类疫苗制备的人二倍体细胞系。于1962年7月来源于因治疗流产3月龄胚胎，由胰酶消化人胚胎肺组织（human embryonic lung）建立原代细胞，细胞形态为纤维母细胞样或成纤维细胞，2n=46，染色体组型（karyotype）是46，XX，正常女性二倍体，G6PD同工酶为B型；它的有限生命周期为50～60代。胸苷标记指数（thymidine labelling index）为86%。Hayflick是第一个建立正常人二倍体细胞的研究者，他于1961年发表了有关该细胞保存方法的论文，当时他将此细胞用于人类衰老的研究。正是利用这种能够连续传代的正常人类细胞株，Hayflick制造了第一个口服脊髓灰质炎病疫苗。随后，WI- 38细胞被用于生产风疹、麻疹、水痘、狂犬病、腮腺炎、甲型肝炎等疫苗。有超过10亿的疫苗受者接受过以WI- 38细胞培养制造的疫苗。由于某种原因，目前WI- 38细胞基本被MRC- 5细胞所代替。培养基和添加剂：含1. 0mmol/L丙酮酸钠，0. 1mmol/L非必需氨基酸和1. 5g/L碳酸氢钠的EMEM，90%；胎牛血清，10%。培养液中添加TNF-α可以促进细胞生长。2）MRC- 5细胞MRC- 5细胞来源于人胚肺（human fetal lung fibroblast），MRC- 5细胞系于1966年9月从27岁孕妇因精神病而流产的14周龄胚胎建立起来的，细胞形态为纤维母细胞样，染色体组型是46，XY，正常男性二倍体，G6PD同工酶为B型；它的有限生命周期为42～48代，2n=46，占70%，多倍体细胞占3. 6%。培养条件：消化传代可以1∶5分传，无特殊要求；典型的培养条件为：细胞单层用0. 25%（W/V）胰酶-0. 53mmol/ L EDTA冲洗和消化5～15分钟，1∶2～1∶5分传后，于37. 0℃、95%空气、5%CO2下培养。培养基：含2mmol/L L-谷氨酰胺、10%胎牛血清的MEM Eagle- Earle。于每周换1～2次培养液维持。可以95%完全培养基、5%DMSO作为冷冻保存液。目前，此细胞系已被用于许多减毒活疫苗的生产，例如水痘疫苗、风疹疫苗等，以及灭活疫苗如狂犬病疫苗。ATCC编号为No. CCL- 171（2）我国的人二倍体细胞1）2BS2BS是由北京生物制品研究所于1973年11月开始建立的一株人二倍体细胞。此细胞株原始材料来源于由医院妇产科提供的一女性胎儿，3月胎龄，系第一胎。母亲23岁，双亲身体健康，家族中无肿瘤及遗传性疾病史。该细胞株以1∶2比例分传，在体外培养历经8个月，共传66代。1∶2比例分传时，3～4天形成致密单层；1∶4比例分传时，则需6～7天。20～40代时，细胞形态好，分裂旺盛；至50代时，单位培养面积的细胞产量相继有所降低；60代以后，衰老期细胞数量不稳定，单位培养面积的细胞产量急剧下降，以致66代时，分裂终止，细胞死亡。研究者认为35代前适合用于疫苗生产。整二倍体细胞占86. 5%。基础培养基为BME。2）KMB17KMB17是由中国医学科学院医学生物学研究所于1973年10月开始建立的一株人二倍体细胞。此细胞株原始材料来源于由云南省第一人民医院妇产科提供的一女性胎儿，4月胎龄，属第二胎，为计划生育关系要求终止妊娠，经水囊引产。母亲20岁，父母双方身体健康，三代直系亲属中无肿瘤及遗传性疾病史。该细胞株以1∶2比例分传，在体外培养历经9个月零5天，共传67代（约合70次细胞群体分裂）。3～40代时，细胞形态好，分裂旺盛；41～60代期间，形态未见明显差异，单位培养面积的细胞产量相继有所降低；61代以后，细胞明显衰老，形成单层时间逐代延长，单位培养面积的细胞产量急剧下降，以致67代时，分裂终止，细胞死亡。传代到3代时，作为原始细胞库；传代到6代时，作为主细胞库。染色体检查证明，人二倍体细胞KMB17在整个传代过程中始终保持人二倍体细胞的特性。对冻存细胞检测未发现细菌、真菌、支原体及潜在病毒因子污染。KMB17细胞经10年冻存后其生物学性状无明显变化。整二倍体细胞占88. 3%。基础培养基为MEM。1977年，在卫生部的领导下，由协作组对当时国内的3个细胞株进行了全面会同检定。结果表明，人二倍体细胞2BS和KMB17来源及历史清楚，早代有大量细胞种子冻存，传代寿命分别为63～66代、62～67代。对5个非连续代次检查均未发现细菌、真菌、支原体污染。通过细胞直接观察、细胞培养检查、动物实验检查、包涵体、乙肝表面抗原及电镜共6个方面多次检查，未发现潜在病毒因子污染。用抗胸腺细胞血清致敏小鼠（或乳鼠）进行致癌性检查，未发现移植瘤。对8株病毒的敏感性试验初步表明，2BS和KMB17对病毒有较广谱的敏感性。根据1971年国际占松会议及国内1975年制定的《制备疫苗的人二倍体细胞株暂行管理办法》有关标准，2BS和KMB17胞核学各项检查结果均符合要求。经卫生部批准，2BS和KMB17人二倍体细胞株可用于疫苗研制和生产。2BS和KMB17也符合2000年版《中国生物制品规程》一部“人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规程”规定，可用于疫苗生产。2BS和KMB17已经用于脊髓灰质炎减毒活疫苗、风疹活疫苗，同时还用于H2甲型肝炎减毒活疫苗、吕-8株甲型肝炎灭活疫苗的制备。三传代细胞传代细胞是指那些能够无限分裂繁殖传代培养的细胞系；传代细胞系的染色体是不正常的非整倍体，大多为亚二倍体（hypodiploid），有个别细胞经过多代次培养传代之后，甚至呈多倍体。有些细胞使用不同的培养方法和培养基经过多代次培养传代之后，可以分化成为许多亚系，在亚系之间的生物学性状有所差异。根据细胞的来源和本质又可以划分为两种细胞类型：转化性细胞和肿瘤源细胞。后者直接来源于肿瘤组织，一般不能用作为疫苗等生物制品生产的细胞基质。现在常用于疫苗生产的转化性细胞，以Vero细胞为代表，它已经广泛地用于多种疫苗的生产制造。选用传代细胞生产疫苗时，应该考虑的原则是：细胞历史背景清楚；一般选择转化细胞系而不选择肿瘤源细胞系；控制一定的培养代次，在特定的代次内其细胞核型和数目不会发生明显的变化；无致肿瘤源性；对病毒敏感，病毒滴度高或产毒量高，最好是不产生干扰素的细胞系；病毒在该细胞系培养之后，与原型株病毒相比，不会出现明显的变异，即不影响病毒培养物的免疫原性和抗原性；容易培养或规模化培养等。常用于疫苗等生物制品生产的传代细胞有如下几种：非洲绿猴肾细胞（African green monkey kidney）之一的Vero细胞；Madin- Darby犬肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、昆虫细胞Sf- 9。1Vero细胞Vero细胞是一种非洲绿猴（Cercopithecus aethiops）肾细胞，由日本千叶（Chiba）大学的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日建立细胞系，它的命名是以世界语（Esperanto）绿色肾“Verda Reno”经缩写而成Vero，实际上，Vero一词在世界语里亦有“真实”之义。Vero细胞系于1964年6月15日由B. Simizu博士带到美国的热带病毒学实验室（laboratory of tropical virology）、国立变态反应和传染病研究所（NIAID）、国立卫生研究院（NIH），此细胞的传代水平是第93代。于第113代传代水平时，再提交给美国典型培养物典藏中心（ATCC），在ATCC培养传至第121代，并且建库。Vero细胞系是染色体不正常的非整倍体（aneuploid）细胞系，可以无限期培养生长（grow indefinitely in culture）。有60%的细胞中染色体条数在2n=58；ATCC称它为亚二倍体（hypodiploid）。它在被免疫抑制的啮齿类动物体内不形成肿瘤，因而被认为是“正常的”。Vero细胞与其他哺乳类动物细胞不一样，属于Ⅰ型干扰素缺陷：当Vero细胞被病毒感染时，它不能分泌Ⅰ型干扰素。但是，它们仍然保留着α/β干扰素的受体，对外源加入的干扰素会产生应答。我国用于疫苗制备的Vero细胞系染色体条数大多在2n=56～58。法国Merieux研究所公布的对Vero细胞致肿瘤源性（tumorigenicity）检测结果显示：用142、161、169、191、211代的Vero细胞接种地鼠、免疫抑制新生大鼠、小鼠裸鼠，每只动物接种的细胞量为106或107，只有接种191、211代的Vero细胞的动物出现进行性生长小结节以及肺部、淋巴结节转移。美国FDA专人的实验结果是：127～140代和162～265代Vero细胞均在软琼脂上形成集落（colonies）、在器官培养中出现肿瘤；162～265代Vero细胞接种小鼠裸鼠形成肿瘤，127～140代Vero细胞实验组则为阴性。因此，大多数疫苗生产企业使用的细胞代次都在130’s或140’s。细胞培养条件消化传代可达以1∶4分传。最早将Vero细胞系引入疫苗生产是Merieux研究所（现属为Aventis Pasteur），自从20世纪80年代起，该公司利用Vero细胞制造的灭活脊髓灰质炎病疫苗（IPV）、口服脊髓灰质炎病活疫苗、灭活狂犬病疫苗在法国已得到批准生产上市。在美国，于1990年批准IPV生产上市，此疫苗现正在美国进行广泛的婴幼儿基本免疫程序的疫苗接种。WHO早在1980年就推荐可使用Vero细胞生产灭活脊髓灰质炎病疫苗和狂犬病疫苗，后来又推荐用于流感病毒疫苗的生产。目前，此细胞系还用于多种灭活疫苗的生产，例如甲型肝炎疫苗、流行性出血热疫苗等，以及正在研究开发的EV71疫苗。现已证明，Vero细胞对许多病毒的感染敏感，如SV-40、SV- 5、麻疹病毒、虫媒病毒（arboviruses）、呼肠孤病毒（reoviruses）、猴腺病毒（simian adenoviruses）、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒（parainfluenza viruses）、呼吸道合胞病毒、痘苗病毒（vaccinia）、轮状病毒、乙型脑炎病毒以及其他病毒等。值得一提的是，只有1962年分离培养的Vero细胞，即ATCC编号为No. CCL-81的细胞株和WHO、欧洲细胞培养物收藏中心（ECACCs）编号88020401细胞株才是用于生物制品疫苗生产的细胞基质。Vero E6难以培养，形成单层的时间长，不适用于生物制品生产的细胞基质，它的ATCC编号为CRL-1586；Vero E6细胞是从Vero 76分离的克隆株，而Vero 76细胞是于1968年从Vero细胞再分离的克隆株，它的ATCC编号为CRL-1587。Vero细胞还有许多其他用途，例如，可以利用它筛选和鉴定埃氏大肠杆菌（Escherichia coli）、志贺菌毒素，以及类毒素的检测等。还用于多种病毒灭活效果的验证试验。2中国仓鼠卵巢细胞中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）是1957年由T. T. Puck从一只成年中国仓鼠卵巢组织进行细胞培养而获建株的。呈上皮样贴壁生长，贴壁强度适中，核型为亚二倍体，2n = 22。目前，已有多个突变衍生株。CHO被广泛使用于实验室的K1亚克隆株需要脯氨酸，因为遗传学上有缺陷，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛。该细胞是上皮样细胞，它的特点是通常贴壁生长，也可悬浮生长，生长繁殖速度快。消化传代可以1∶3～1∶10分传。对于剪切力和渗透压有较高的忍受能力。它与大肠杆菌相比，优点在于表达的蛋白质产物能进行翻译后糖基化修饰。CHO细胞被广泛地用来表达重组DNA的蛋白。我国已成功地利用CHO细胞构建表达HBsAg的工程细胞生产乙型肝炎疫苗，此CHO是经过诱导突变的，不同于CHO- k1，是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株（CHO- dhfr-）。CHO- k1细胞株的ATCC编号是No. CCL-61。目前，CHO细胞仅以基因工程细胞株用于疫苗和抗体的制备，而不是作为传统意义的病毒感染的细胞基质。3Madin- Darby犬肾细胞Madin- Darby犬肾细胞（Madin- Darby canine kidney，MDCK）是由SH Madin和NB Darby于1958年8月取自外观健康的英国成年小猎犬（Cocker spaniel）肾培养建株，呈吸附生长的上皮细胞样细胞。染色体组核型（karyotype）2n= 78；ATCC认为它有0. 2%的细胞呈多倍体（polyploidy）。它能分泌Ⅰ型干扰素，而且糖基化谱也与Vero细胞不同。免疫酶染色法显示，该细胞呈角质蛋白阳性。经过长期的传代培养之后，有人通过比较已发表的文献发现，不同的MDCK细胞有很多差异。有证据表明，培养基成分可以影响MDCK细胞是否具有致肿瘤性，尤其是无血清培养基。欧洲已经批准该细胞用于生产流感疫苗，目前，此细胞系仅用于灭活流行性感冒病毒疫苗的生产，也是唯一的使用用途。用于疫苗生产的MDCK细胞株应是ATCC编号为MDCK CCL- 34（NBL- 2），欧洲细胞培养物收藏中心（ECACCs）编号为MDCK 841211903和MDCK 33016的细胞系。与鸡胚相比，MDCK 33016株培养流感病毒，其HA的产量比鸡胚高2～10倍。而且不会造成子代病毒的变异。有人曾经用MDCK细胞和鸡胚从临床样品中间分离培养H3N2流感病毒进行比较，发现利用MDCK分离培养的H3N2流感病毒，其HA的抗原性和结构都没有发生变化，利用鸡胚分离培养的H3N2流感病毒出现了结构和抗原性3个亚群体（sub- population）的差异，主要表现在HA1的氨基酸序列上。诺华（Novartis）MDCK株与BHK- 21/BRS、PER. C6一样，现在可以实现非贴壁依赖细胞培养和无血清培养病毒，而且可以在生物反应器中规模生产流感疫苗；在生物反应器培养细胞的规模放大速度明显比贴壁依赖细胞系培养快。MDCK细胞可以感染人柯萨奇病毒（Coxsackie virus）B3、B4、B5，2型人脊髓灰质炎病毒，呼肠孤病毒（reovirus）2型，痘病毒，腺病毒，腺病毒相关病毒（adeno- associated virus）4、5型，印度株VSV，传染性犬肝炎病毒等。4昆虫Sf- 9细胞它是草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞株IPLB- Sf- 9。早在1977年由美国Henry A. Wallace Beltsville农业研究中心建立的IPLB- SF 21 AE，德州A＆M大学G. E. Smith和C. L. Cherry于1983年再从细胞株IPLB- SF 21 AE亚克隆得到一个细胞株IPLB- Sf- 9。它是上皮细胞，生长繁殖速度快，对外界环境适应性强，既可贴壁又可悬浮生长培养，培养温度可低至27℃，生长pH 6. 0～6. 4，能耐受的渗透压范围为340～390mOsm/kg，比一般的哺乳类动物细胞高。容易适应无血清培养，如无血清培养基SF- 900Ⅱ。细胞在悬浮培养瓶中直接静置30～60分钟即可贴壁，传代时不需酶消化，用吸管轻轻吹打或用手从侧面拍打细胞培养瓶即可使细胞脱落。以1∶5分传培养为宜，或更高比例分传亦可，每2～3天传代1次，于28℃培养，不必使用CO2培养箱。TNM- FH培养液：Grace’s Antheraea培养液加10%的热灭活胎牛血清（FBS），每升培养液再添加3. 3g酵母粉和3. 3g乳白蛋白水解物，用1mol/L KOH调pH到6. 2～6. 4过滤除菌，4℃保存。现在利用Sf- 9细胞培养病毒，尤其是杆状病毒（baculovirus），用于生产重组蛋白，通常的表述都是Sf- 9细胞/杆状病毒系统，此时，细胞/杆状病毒系统多表示为重组型的杆状病毒。利用Sf- 9细胞/杆状病毒系统，国外一家公司已经成功研究开发了人乳头瘤病毒VLP疫苗。早期，我国的研究人员曾经利用Sf- 9细胞作为制备乙脑疫苗生产用细胞基质进行了研究探索。5新开发的疫苗细胞基质昆虫细胞系有Sf- 9、Hi- 5，致瘤性细胞系（tumorigenic cell lines）包括有人源细胞系PER. C6、293细胞和犬类MDCK细胞。目前，其中有些已经在个别国家取得生产批准。但是，美国FDA对于这些细胞仍存疑虑，美国FDA所属的生物制品评价中心（CBEA）把它们列入需要进一步研究考察的细胞基质。目前，正在研究的热点传代细胞有PER. C6，由荷兰Leiden大学的Fallaux、F. J.等人于1996年建株，来源于视网膜细胞，他们建立PER. C6细胞株的原本目的是用作腺病毒5型培养的工程辅助细胞，第5型腺病毒是用于基因治疗的基因表达载体。Fallaux、F. J.等人于1998年发表PER. C6细胞建株的论文，后来有人将此细胞用于培养流感病毒，并且获得成功，得到世人的瞩目，国外已有跨国集团出巨资购买和资助研究PER. C6细胞株用作为病毒性疫苗生产的细胞基质。PER. C6细胞株起源于18周龄人胚胎视网膜细胞（human embryonic retina cells），初期培养的人胚胎视网膜母细胞（human embryonic retinoblast，HER）称为911细胞，利用含有第5型腺病毒E1A. E1B基因的质粒pIG. E1A. E1B转染911细胞，根据转染的染色体位点不同，他们建立了7个细胞系，把含有并且能够表达E1A. E1B蛋白质的细胞系统称为PER细胞，PER. C6细胞就是其中之一。因此，PER. C6细胞又被称为“被设计”的细胞系（designer cell line）。PER. C6细胞带有第5型腺病毒基因组459～3510碱基序列（E1A. E1B基因），E1A. E1B基因是由人磷酸甘油酸酯激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）启动子调控的。Fallaux等人证明，即使以复制缺陷型腺病毒感染PER. C6细胞，PER. C6细胞也不会产生有复制能力的腺病毒（replication- competent adenoviruses，RCAs）。细胞尺寸大小在低代次时为17. 7μm、在高代次的对数生长期为～18.5μm。利用PER. C6细胞培养流感病毒，其培养时间和病毒浓度都可与鸡胚培养技术相比；病毒产量可提高10倍。PER. C6细胞的典型培养液是含10%胎牛血清的DMEM，条件是5% CO2和湿温37℃。总 结对于理想的疫苗用细胞基质而言，新细胞系应可传代，且具已知转化条件和背景，在人类体内使用是安全的，培养条件不苛刻，具有非贴壁依赖生长及在无血清细胞条件下培养能力，分裂生长速度快，对于大部分病毒敏感，病毒培养的感染滴度或产量明显高于其他细胞。目前，没有理想化的十全十美细胞，各自都有自身的优点和缺陷，研究者可以根据本身的条件及目的病毒的特性选取细胞系。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

点击上方图片链接可报名病毒的生长和复制需要依存于活体生物或者是生物的组织与细胞；用于体外培养病毒的细胞统称为细胞基质（cell matrix）。细胞培养是指离体的细胞在特定的条件下在体外进行生长、分裂繁殖的过程。目前，可以用于疫苗等生物制品的细胞基质有多种细胞，例如各种动物的原代细胞、二倍体细胞、传代细胞。根据细胞生长的模式和要求又可以划分为两种细胞生长类型，即贴壁依赖细胞（anchorage-dependent）和非贴壁依赖细胞（anchorage- independent）。贴壁依赖细胞需要黏着或依附在一定的载体上才能良好生长繁殖，单一游离细胞不能良好生长繁殖，典型的代表是单层细胞培养。非贴壁依赖细胞则是单一游离细胞就能够良好生长繁殖，体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长，及时传代后，细胞的生长繁殖得以继续。二倍体细胞是贴壁依赖、接触抑制生长的，有些细胞则是贴壁依赖、接触促进生长的，可以快速形成致密单层，甚至是多层。一、细胞类型及来源用于制造病毒性疫苗的细胞类型有原代细胞、二倍体细胞、传代细胞。研究人员可以根据实际需要和自身的条件选取某一类型的细胞开展疫苗的研究开发工作条件选取某一类型的细胞开展疫苗的研究开发工作。（一）动物的原代细胞将新鲜动物组织剪碎、消化、分散后，在适当条件下进行培养的细胞称为原代细胞，它们不能进行多代次的长期无限的培养，经过一定代次培养后，该细胞再也不能生长繁殖，直到衰老死亡和凋亡。一般将动物组织消化培养的第一代细胞称为原代细胞，第二代细胞称为次代细胞，如此类推。1.细胞类型根据不同动物组织来源，有地鼠肾细胞、沙鼠肾细胞、牛肾细胞、鸡胚成纤维细胞等。2.特点如果来源于无特定病原体（SPF）动物，细胞受外源因子污染的概率较低，一般不存在致癌基因和致癌蛋白，故致肿瘤源性的可能性极低。3.应用可用于减毒活疫苗和灭活疫苗生产。迄今为止，在我国已经批准生产的疫苗如下：地鼠肾细胞可用于狂犬病疫苗、乙型脑炎疫苗生产；沙鼠肾细胞可用于流行性出血热疫苗生产；牛肾细胞可用于轮状病毒减毒活疫苗；鸡胚成纤维细胞可用于麻疹减毒活疫苗、流行性腮腺炎减毒活疫苗、狂犬病灭活疫苗等；狗肾细胞和兔肾细胞曾用于风疹减毒活疫苗生产。（二）二倍体细胞二倍体细胞是指那些能够在一定细胞周期即一定代次范围内进行有限传代培养的细胞系；一般情况下最多只能传代培养50～100代。因为它们的细胞核的染色体在一定代次数内仍然是二倍数的，故而得名二倍体细胞。而且，它们的细胞结构仍然与来源生物供体的细胞有一致性。在正常情况下，它们的生命周期有限，因此，它是一种半传代细胞。1.细胞类型二倍体细胞又可以分为人类二倍体细胞和动物二倍体细胞。人二倍体细胞（HDCs）是指那些来源于正常人体组织并且能在体外进行培养的细胞。一般来源于人类胚胎肺、肾等组织，其染色体数目与原供体细胞染色体相同或基本相同，2n细胞占80%以上。目前全球用于疫苗生产制备的二倍体细胞有几个细胞株，在国外建立并且得到批准用于疫苗生产的二倍体细胞有人类二倍体细胞WI- 38、MRC- 5、猕猴胚胎肺二倍体细胞FRhL- 2。我国人二倍体细胞有2BS和KMB17。2.特点二倍体细胞虽然比其他传代细胞具有更佳的安全性，许多疫苗都以二倍体细胞培养的疫苗作为金标准。但是，由于它们分裂生长速度慢，对于某些病毒不甚敏感，对某些病毒的培养感染滴度或产量明显低于其他细胞。例如，MRC- 5细胞培养流感病毒冷适应株A/Ann/Arbor/6/60的产量就比用原代鸡肾细胞和原代鸡胚肾细胞培养低100倍。另外，一般认为，二倍体细胞难以适应柱型搅拌式生物反应器培养。3.应用可用于减毒活疫苗和灭活疫苗生产。在国外使用的人二倍体细胞系有MRC- 5、WI- 38细胞。在国内建立并且得到批准用于疫苗生产的二倍体细胞有2BS、KMB17细胞。下面详细介绍一下这几种细胞， 分国外和国内两大类介绍。（1）国外的人二倍体细胞系1）WI- 38人二倍体细胞系：WI- 38细胞由美国Wistar研究所（Wistar institute）的L. Hayflick和他的同事所建立的，故名为WI-38（详细故事大家可以参考《疫苗竞赛》，故事非常精彩），是世界上第一个建株的正常人二倍体细胞，也是首株用于人类疫苗制备的人二倍体细胞系。于1962年7月来源于因治疗流产3月龄胚胎，由胰酶消化人胚胎肺组织（human embryonic lung）建立原代细胞，细胞形态为纤维母细胞样或成纤维细胞，2n=46，染色体组型（karyotype）是46，XX，正常女性二倍体，G6PD同工酶为B型；它的有限生命周期为50～60代。胸苷标记指数（thymidine labelling index）为86%。Hayflick是第一个建立正常人二倍体细胞的研究者，他于1961年发表了有关该细胞保存方法的论文，当时他将此细胞用于人类衰老的研究。正是利用这种能够连续传代的正常人类细胞株，Hayflick制造了第一个口服脊髓灰质炎病疫苗。随后WI- 38细胞被用于生产风疹、麻疹、水痘、狂犬病、腮腺炎、甲型肝炎等疫苗。有超过10亿的疫苗受者接受过以WI- 38细胞培养制造的疫苗。由于某种原因，目前WI- 38细胞基本被MRC- 5细胞所代替。培养基和添加剂：含1. 0mmol/L丙酮酸钠，0. 1mmol/L非必需氨基酸和1. 5g/L碳酸氢钠的EMEM，90%；胎牛血清，10%。培养液中添加TNF-α可以促进细胞生长。2）MRC- 5细胞：MRC- 5细胞来源于人胚肺（human fetal lung fibroblast），MRC- 5细胞系于1966年9月从27岁孕妇因精神病而流产的14周龄胚胎建立起来的，细胞形态为纤维母细胞样，染色体组型是46，XY，正常男性二倍体，G6PD同工酶为B型；它的有限生命周期为42～48代，2n=46，占70%，多倍体细胞占3. 6%。培养条件消化传代可以1∶5分传，无特殊要求，培养基是含2mmol/L L-谷氨酰胺、10%胎牛血清的MEM Eagle- Earle。典型的培养条件为：细胞单层用0. 25%（W/V）胰酶-0. 53mmol/ L EDTA冲洗和消化5～15分钟，1∶2～1∶5分传后，于37. 0℃、95%空气、5%CO2下培养。于每周换1～2次培养液维持。可以95%完全培养基、5%DMSO作为冷冻保存液。目前，此细胞系已被用于许多减毒活疫苗的生产，例如水痘疫苗、风疹疫苗等，以及灭活疫苗如狂犬病疫苗。ATCC编号为No. CCL- 171（2）我国的人二倍体细胞：2BS是由北京生物制品研究所于1973年11月开始建立的一株人二倍体细胞。此细胞株原始材料来源于由医院妇产科提供的一女性胎儿，3月胎龄，系第一胎。母亲23岁，双亲身体健康，家族中无肿瘤及遗传性疾病史。该细胞株以1∶2比例分传，在体外培养历经8个月，共传66代。1∶2比例分传时，3～4天形成致密单层；1∶4比例分传时，则需6～7天。20～40代时，细胞形态好，分裂旺盛；至50代时，单位培养面积的细胞产量相继有所降低；60代以后，衰老期细胞数量不稳定，单位培养面积的细胞产量急剧下降，以致66代时，分裂终止，细胞死亡。研究者认为35代前适合用于疫苗生产。整二倍体细胞占86. 5%。基础培养基为BME。KMB17是由中国医学科学院医学生物学研究所于1973年10月开始建立的一株人二倍体细胞。此细胞株原始材料来源于由云南省第一人民医院妇产科提供的一女性胎儿，4月胎龄，属第二胎，为计划生育关系要求终止妊娠，经水囊引产。母亲20岁，父母双方身体健康，三代直系亲属中无肿瘤及遗传性疾病史。该细胞株以1∶2比例分传，在体外培养历经9个月零5天，共传67代（约合70次细胞群体分裂）。3～40代时，细胞形态好，分裂旺盛；41～60代期间，形态未见明显差异，单位培养面积的细胞产量相继有所降低；61代以后，细胞明显衰老，形成单层时间逐代延长，单位培养面积的细胞产量急剧下降，以致67代时，分裂终止，细胞死亡。传代到3代时，作为原始细胞库；传代到6代时，作为主细胞库。染色体检查证明人二倍体细胞KMB17在整个传代过程中始终保持人二倍体细胞的特性。对冻存细胞检测未发现细菌、真菌、支原体及潜在病毒因子污染。KMB17细胞经10年冻存后其生物学性状无明显变化。整二倍体细胞占88. 3%。基础培养基为MEM。1977年，在卫生部的领导下，由协作组对当时国内的3个细胞株进行了全面会同检定。结果表明，人二倍体细胞2BS和KMB17来源及历史清楚，早代有大量细胞种子冻存，传代寿命分别为63～66代、62～67代。对5个非连续代次检查均未发现细菌、真菌、支原体污染。通过细胞直接观察、细胞培养检查、动物实验检查、包涵体、乙肝表面抗原及电镜共6个方面多次检查，未发现潜在病毒因子污染。用抗胸腺细胞血清致敏小鼠（或乳鼠）进行致癌性检查，未发现移植瘤。对8株病毒的敏感性试验初步表明，2BS和KMB17对病毒有较广谱的敏感性。根据1971年国际占松会议及国内1975年制定的《制备疫苗的人二倍体细胞株暂行管理办法》有关标准，2BS和KMB17胞核学各项检查结果均符合要求。经卫生部批准，2BS和KMB17人二倍体细胞株可用于疫苗研制和生产。2BS和KMB17也符合2000年版《中国生物制品规程》一部“人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规程”规定，可用于疫苗生产。2BS和KMB17已经用于脊髓灰质炎减毒活疫苗、风疹活疫苗。还用于H2甲型肝炎减毒活疫苗、吕-8株甲型肝炎灭活疫苗的制备。（三）传代细胞传代细胞是指那些能够无限分裂繁殖传代培养的细胞系；传代细胞系的染色体是不正常的非整倍体，大多为亚二倍体（hypodiploid），有个别细胞经过多代次培养传代之后，甚至呈多倍体。有些细胞使用不同的培养方法和培养基经过多代次培养传代之后，可以分化成为许多亚系，在亚系之间的生物学性状有所差异。根据细胞的来源和本质又可以划分为两种细胞类型：转化性细胞和肿瘤源细胞。后者直接来源于肿瘤组织，一般不能用作为疫苗等生物制品生产的细胞基质。现在常用于疫苗生产的转化性细胞，以Vero细胞为代表，它已经广泛地用于多种疫苗的生产制造。选用传代细胞生产疫苗时，应该考虑的原则是：细胞历史背景清楚；一般选择转化细胞系而不选择肿瘤源细胞系；控制一定的培养代次，在特定的代次内其细胞核型和数目不会发生明显的变化，以及无致肿瘤源性；对病毒敏感，病毒滴度高或产毒量高，最好是不产生干扰素的细胞系；病毒在该细胞系培养之后，与原型株病毒相比，不会出现明显的变异，即不影响病毒培养物的免疫原性和抗原性；容易培养或规模化培养等。常用于疫苗等生物制品生产的传代细胞有如下几种：非洲绿猴肾细胞（African green monkey kidney）之一的Vero细胞；Madin- Darby犬肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、昆虫细胞Sf- 9。1. Vero细胞Vero细胞是一种非洲绿猴（Cercopithecus aethiops）肾细胞，由日本千叶（Chiba）大学的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日建立细胞系，它的命名是以世界语（Esperanto）绿色肾“Verda Reno”经缩写而成Vero，实际上，Vero一词在世界语里亦有“真实”之义。Vero细胞系于1964年6月15日由B. Simizu博士带到美国的热带病毒学实验室（laboratory of tropical virology）、国立变态反应和传染病研究所（NIAID）、国立卫生研究院（NIH），此细胞的传代水平是第93代。于第113代传代水平时，再提交给美国典型培养物典藏中心（ATCC），在ATCC培养传至第121代，并且建库。Vero细胞系是染色体不正常的非整倍体（aneuploid）细胞系，可以无限期培养生长（grow indefinitely in culture）。有60%的细胞中染色体条数在2n=58；ATCC称它为亚二倍体（hypodiploid）。它在被免疫抑制的啮齿类动物体内不形成肿瘤，因而被认为是“正常的”。它与其他哺乳类动物细胞不一样，属于Ⅰ型干扰素缺陷的，当Vero细胞被病毒感染时，它不能分泌Ⅰ型干扰素。但是，它们仍然保留着α/β干扰素的受体，对外源加入的干扰素会产生应答。我国用于疫苗制备的Vero细胞系染色体条数大多在2n=56～58。法国Merieux研究所公布的对Vero细胞致肿瘤源性（tumorigenicity）检测结果显示，用142、161、169、191、211代的Vero细胞接种地鼠、免疫抑制新生大鼠、小鼠裸鼠，每只动物接种的细胞量为106或107，只有接种191、211代的Vero细胞的动物出现进行性生长小结节以及肺部、淋巴结节转移。美国FDA专人的实验结果是：127～140代和162～265代Vero细胞均在软琼脂上形成集落（colonies）、在器官培养中出现肿瘤；162～265代Vero细胞接种小鼠裸鼠形成肿瘤，127～140代Vero细胞实验组则为阴性。因此，大多数疫苗生产企业使用的细胞代次都在130’s或140’s。细胞培养条件消化传代可达以1∶4分传。最早将Vero细胞系引入疫苗生产是Merieux研究所（现属为Aventis Pasteur），自从20世纪80年代起，该公司利用Vero细胞制造的灭活脊髓灰质炎病疫苗（IPV）、口服脊髓灰质炎病活疫苗、灭活狂犬病疫苗在法国已得到批准生产上市。在美国，于1990年批准IPV生产上市，此疫苗现正在美国进行广泛的婴幼儿基本免疫程序的疫苗接种。WHO早在1980年就推荐可使用Vero细胞生产灭活脊髓灰质炎病疫苗和狂犬病疫苗，后来又推荐用于流感病毒疫苗的生产。目前，此细胞系还用于多种灭活疫苗的生产，例如甲型肝炎疫苗、流行性出血热疫苗等，以及正在研究开发的EV71疫苗。现已证明Vero细胞对许多病毒的感染敏感，如SV-40、SV- 5、麻疹病毒、虫媒病毒（arboviruses）、呼肠孤病毒（reoviruses）、猴腺病毒（simian adenoviruses）、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、副流感病毒（parainfluenza viruses）、呼吸道合胞病毒、痘苗病毒（vaccinia）、轮状病毒、乙型脑炎病毒以及其他病毒等。值得一提的是，只有1962年分离培养的Vero细胞，即ATCC编号为No. CCL-81的细胞株和WHO、欧洲细胞培养物收藏中心（ECACCs）编号88020401细胞株才是用于生物制品疫苗生产的细胞基质。Vero E6难以培养，形成单层的时间长，不适用于生物制品生产的细胞基质，它的ATCC编号为CRL-1586；Vero E6细胞是从Vero 76分离的克隆株，而Vero 76细胞是于1968年从Vero细胞再分离的克隆株，它的ATCC编号为CRL-1587。Vero细胞还有许多其他用途，例如，利用它筛选和鉴定埃氏大肠杆菌（Escherichia coli）、志贺菌毒素，以及类毒素的检测等。还用于多种病毒灭活效果的验证试验。2.中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）CHO细胞是1957年由T. T. Puck从一只成年中国仓鼠卵巢组织进行细胞培养而获建株的。呈上皮样贴壁生长，贴壁强度适中，核型为亚二倍体，2n = 22。目前，已有多个突变衍生株。被广泛使用于实验室的K1亚克隆株需要脯氨酸，因为遗传学上有缺陷，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ-半醛。该细胞是上皮样细胞，它的特点是通常贴壁生长，也可悬浮生长，生长繁殖速度快。消化传代可以1∶3～1∶10分传。对于剪切力和渗透压有较高的忍受能力。它与大肠杆菌相比，优点在于表达的蛋白质产物能进行翻译后糖基化修饰。CHO细胞被广泛地用来表达重组DNA的蛋白。我国已成功地利用CHO细胞构建表达HBsAg的工程细胞生产乙型肝炎疫苗，此CHO是经过诱导突变的，不同于CHO- k1，是缺失二氢叶酸还原酶的细胞株（CHO- dhfr-）。CHO- k1细胞株的ATCC编号是No. CCL-61。目前，CHO细胞仅以基因工程细胞株用于疫苗和抗体的制备，而不是作为传统意义的病毒感染的细胞基质。3. Madin- Darby犬肾细胞（Madin- Darby canine kidney，MDCK）由SH Madin和NB Darby于1958年8月取自外观健康的英国成年小猎犬（Cocker spaniel）肾培养建株，呈吸附生长的上皮细胞样细胞。染色体组核型（karyotype）2n= 78；ATCC认为它有0. 2%的细胞呈多倍体（polyploidy）。它能分泌Ⅰ型干扰素，而且糖基化谱也与Vero细胞不同。免疫酶染色法显示，该细胞呈角质蛋白阳性。经过长期的传代培养之后，有人通过比较已发表的文献发现，互相之间的MDCK细胞已经有很多差异。有证据表明，培养基成分可以影响MDCK细胞是否具有致肿瘤性，尤其是无血清培养基。欧洲已经批准该细胞用于生产流感疫苗，目前，此细胞系仅用于灭活流行性感冒病毒疫苗的生产，也是唯一的使用用途。用于疫苗生产的MDCK细胞株应是ATCC编号为MDCK CCL- 34（NBL- 2），欧洲细胞培养物收藏中心（ECACCs）编号为MDCK 841211903和MDCK 33016的细胞系。与鸡胚相比，MDCK 33016株培养流感病毒，其HA的产量比鸡胚高2～10倍。而且不会造成子代病毒的变异。有人曾经用MDCK细胞和鸡胚从临床样品中间分离培养H3N2流感病毒进行比较，发现利用MDCK分离培养的H3N2流感病毒，其HA的抗原性和结构都没有发生变化，利用鸡胚分离培养的H3N2流感病毒出现了结构和抗原性3个亚群体（sub- population）的差异，主要表现在HA1的氨基酸序列上。诺华（Novartis）MDCK株与BHK- 21/BRS、PER. C6一样，现在可以实现非贴壁依赖细胞培养和无血清培养病毒，而且可以在生物反应器中规模生产流感疫苗；在生物反应器培养细胞的规模放大速度明显比贴壁依赖细胞系培养快。MDCK细胞可以感染人柯萨奇病毒（Coxsackie virus）B3、B4、B5，2型人脊髓灰质炎病毒，呼肠孤病毒（reovirus）2型，痘病毒，腺病毒，腺病毒相关病毒（adeno- associated virus）4、5型，印度株VSV，传染性犬肝炎病毒等。4.昆虫Sf- 9细胞它是草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞株IPLB- Sf- 9。早在1977年由美国Henry A. Wallace Beltsville农业研究中心建立的IPLB- SF 21 AE，德州A＆M大学G. E. Smith和C. L. Cherry于1983年再从细胞株IPLB- SF 21 AE亚克隆得到一个细胞株IPLB- Sf- 9。它是上皮细胞，生长繁殖速度快。对外界环境适应性强，既可贴壁又可悬浮生长培养，培养温度可低至27℃，生长pH 6. 0～6. 4，能耐受的渗透压范围为340～390mOsm/kg，比一般的哺乳类动物细胞高。容易适应无血清培养，如无血清培养基SF- 900Ⅱ。细胞在悬浮培养瓶中直接静置30～60分钟即可贴壁，传代时不需酶消化，用吸管轻轻吹打或用手从侧面拍打细胞培养瓶即可使细胞脱落。以1∶5分传培养为宜，或更高比例分传亦可，每2～3天传代1次，于28℃培养，不必使用CO2培养箱。TNM- FH培养液：Grace’s Antheraea培养液加10%的热灭活胎牛血清（FBS），每升培养液再添加3. 3g酵母粉和3. 3g乳白蛋白水解物，用1mol/L KOH调pH到6. 2～6. 4过滤除菌，4℃保存。现在利用Sf- 9细胞培养病毒，尤其是杆状病毒（baculovirus），用于生产重组蛋白，通常的表述都是Sf- 9细胞/杆状病毒系统，此时，细胞/杆状病毒系统多表示为重组型的杆状病毒。利用Sf- 9细胞/杆状病毒系统，国外一家公司已经成功研究开发了人乳头瘤病毒VLP疫苗。早期，我国的研究人员曾经利用Sf- 9细胞作为制备乙脑疫苗生产用细胞基质进行了研究探索。5.新开发的疫苗细胞基质昆虫细胞系有Sf- 9、Hi- 5，致瘤性细胞系（tumorigenic cell lines）包括有人源细胞系PER. C6、293细胞和犬类MDCK细胞。目前，其中有些已经在个别国家取得生产批准。但是，美国FDA对于这些细胞仍存疑虑，美国FDA所属的生物制品评价中心（CBEA）把它们列入需要进一步研究考察的细胞基质。目前，正在研究的热点传代细胞有PER. C6，由荷兰Leiden大学的Fallaux、F. J.等人于1996年建株，来源于视网膜细胞，他们建立PER. C6细胞株的原本目的是用作腺病毒5型培养的工程辅助细胞，第5型腺病毒是用于基因治疗的基因表达载体。Fallaux、F. J.等人于1998年发表PER. C6细胞建株的论文，后来有人将此细胞用于培养流感病毒，并且获得成功，得到世人的瞩目，国外已有跨国集团出巨资购买和资助研究PER. C6细胞株用作为病毒性疫苗生产的细胞基质。PER. C6细胞株起源于18周龄人胚胎视网膜细胞（human embryonic retina cells），初期培养的人胚胎视网膜母细胞（human embryonic retinoblast，HER）称为911细胞，利用含有第5型腺病毒E1A. E1B基因的质粒pIG. E1A. E1B转染911细胞，根据转染的染色体位点不同，他们建立了7个细胞系，把含有并且能够表达E1A. E1B蛋白质的细胞系统称为PER细胞，PER. C6细胞就是其中之一。因此，PER. C6细胞又被称为“被设计”的细胞系（designer cell line）。PER. C6细胞带有第5型腺病毒基因组459～3510碱基序列（E1A. E1B基因），E1A. E1B基因是由人磷酸甘油酸酯激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）启动子调控的。Fallaux等人证明，即使以复制缺陷型腺病毒感染PER. C6细胞，PER. C6细胞也不会产生有复制能力的腺病毒（replication- competent adenoviruses，RCAs）。细胞尺寸大小在低代次时为17. 7μm、在高代次的对数生长期为～18.5μm。利用PER. C6细胞培养流感病毒，其培养时间和病毒浓度都可与鸡胚培养技术相比；病毒产量可提高10倍。PER. C6细胞的典型培养液是含10%胎牛血清的DMEM，条件是5% CO2和湿温37℃。对于理想的疫苗用细胞基质而言，新细胞系应可传代，且具已知转化条件和背景，在人类体内使用是安全的，培养条件不苛刻，具有非贴壁依赖生长及在无血清细胞条件下培养能力，分裂生长速度快，对于大部分病毒敏感，病毒培养的感染滴度或产量明显高于其他细胞。目前，没有理想化的十全十美细胞，各自都有自身的优点和缺陷，研究者可以根据本身的条件及目的病毒的特性选取细胞系。来源 公众号“穷疯子”整理识别微信二维码，添加小编，符合条件者即可申请加入微信群！请注明：姓名+研究方向！声明：本文旨在传递更多信息，版权归原作者所有。原创文章转载均需经过授权并注明来源，如涉及内容、版权或其他问题请时联系小编删除！文章仅代表作者个人观点，并不代表公众号立场。本公众号拥有对此声明的最终解释权！投稿邮箱：yck19876@163.com