Delpacibart zotadirsen

前言 寡核苷酸偶联抗体（Antibody oligonucleotide conjugates, AOC）从分类上属于偶联抗体的一种，类似于目前火热的抗体偶联药物（Antibody drug conjugates, ADC），为寡核苷酸（siRNA或者ASO等）通过定点偶联或非定点偶联在特定靶向性的抗体或抗体片段上（例如可与Transferrin receptor结合的FC片段）构建。在设计理念上，AOC药物是为了拓展寡核苷酸药物的组织/细胞靶向性，目前除了肝脏和少数组织外，寡核苷酸的靶向性是限制其治疗应用的最大瓶颈之一[1]。使用抗体递送Oligo药物的理念最早可以追溯到2005年，那年哈佛大学的Judy Lieberman使用靶向HIV-1衣壳蛋白mRNA的siRNA，将其偶联在抗体FAB片段上，采用基于电荷吸附的鱼精蛋白（protamine）的偶联方式。这个AOC药物的原型成功的将降低了被感染T细胞的HIV病毒表达量，发表在Nature Biotechnology上[2]。本文将从AOC药物的靶向优势、药代动力学研究策略出发，重点介绍AOC药物的生物分析内容及不同检测平台。 图1. AOC药物的结构示意图 由于对抗体以及寡核苷酸成药机理的理解以及生物工程和偶联技术的限制，寡核苷酸偶联抗体早期应用最多的是检测领域，例如免疫PCR（immuno-PCR）。相对传统ELISA方法，它具有非常好的检测灵敏度和线性范围[3]。 伴随着对寡核苷酸药物的成药性，以及特定疾病分子生物学机理的进一步理解，寡核苷酸递送系统局限性对其应用的限制越来越明显，比较成熟的基于LNP以及GalNAc的递送系统仅对肝脏等少数器官有较好的靶向性，而良好的靶向性是决定药物药效与安全性的关键。这就将寡核苷酸偶联抗体这一成药性理念又推到了台前，很多专注于AOC的biotech公司，例如Avidity Biosciences、Tallac Therapeutics、Dyne Therapeutics、Denali Therapeutics等应运而起。在2019年，Avidity推出了全球第一款AOC药物AOC 1001 （Tfr1-targeted mAB for DM1 disease with anti-DMPK siRNA），已进入临床一期[4]。最近Avidity的AOC药物AOC 1044（Tfr1-targeted mAB for DMD disease with anti-DMD PMO）获得FDA fast track和孤儿药资格，进一步推动了AOC药物的研发热情。 与payload为小分子的ADC药物相比，AOC药物有更多的寡核苷酸和抗体的偶联方式。偶联方式会影响寡核苷酸药物的释放进而影响药效。目前主流的偶联方式包括基于电荷亲和，链霉亲和素/生物素的结合，直接偶联以及碱基互补配对偶联，具体描述可以参考相应文献[5]。值得注意的是偶联方式会影响AOC药物偶联Oligo在细胞内溶酶体的释放，这是影响AOC药物药效的关键。并且不同偶联方式的AOC也需要相应的生物分析方法进行药代动力学研究。 图2. 不同AOC药物寡核苷酸偶联策略示意图，包括基于电荷亲和的偶联，基于链霉亲和素/生物素的结合，基于直接偶联以及基于碱基互补配对偶联的方式[5] 对AOC药物的DMPK研究主要包括ADME（Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion）特征的研究，即吸收，分布，代谢和排泄特征的研究。主要分为体外ADME，DDI和体内PK三个部分，涵盖临床前发现，临床前开发以及临床开发等阶段。早期研究主要结合体外药效学和体外稳定性研究，以筛选先导分子。筛选出的多个分子通过临床前阶段的体内药效和体内PK共同研究AOC药物的量效关系和组织分布信息，推进leading AOC进入IND研究阶段。在AOC的DMPK研究中，生物分析在这些复杂的体外体内研究中发挥着重要的作用，因此选择合适的生物分析方法来研究AOC非常重要。 表1. AOC药物不同研发阶段DMPK研究策略概述 与ADC药物类似，AOC药物的生物分析也相对比较复杂，通常无法仅使用传统单一平台进行生物分析，需要结合LBA分析平台，LC-MS分析平台，以及qPCR分析平台等共同完成对AOC药物的生物分析。下图总结了在PK研究中AOC药物的生物分析内容以及涉及到的主要分析平台，包括总抗体（Total antibody）、偶联抗体（Conjugated antibody）、偶联/游离寡核苷酸（Conjugated/free oligo）、免疫原性（Immunogenecity）和生物标志物（Biomarker）等分析内容。下面我们将详细介绍各类AOC药物分析物的生物分析内容及相关内部验证。 图3. AOC药物的整合性生物分析内容及相应分析平台 总抗体分析 AOC药物总抗体的分析与ADC药物类似，通常使用LBA平台完成。在开发AOC药物总抗体方法时需要根据抗体结构、靶点以及研究阶段设计合适的分析方法，如特异性或通用性方法，并根据灵敏度和通量的需求选择合适的分析平台如ELISA或MSD等平台。具体可参考之前发表的公众号文章：基于LBA技术抗体类药物临床前PK生物分析的策略与路径。 图4. AOC药物总抗体ELISA检测形式示意图，A：特异性方法和B：通用性方法 值得注意的是，与ADC类似，AOC总抗体LBA分析方法需要在开发中桥接AOC药物裸抗和AOC药物本身的信号响应（signal response），以确保不会高估AOC裸抗（或其他代谢形式）的浓度，避免计算错误的PK参数（特别是linker不稳定的ADC）。图5展示了桥接通过或不通过可能对于PK曲线的影响示意图。 图5. AOC药物总抗体检测桥接实验对于PK数据影响示意图 从原理而言，这种现象的产生是由于LBA关键试剂亲和力受到空间位阻影响。AOC药物由于在抗体部分偶联有连接子（linker）和寡核苷酸，其三维构型可能会影响LBA关键试剂与抗体部分的结合，这会导致LBA关键试剂和裸抗或其他代谢形式（减去一个或多个偶联oligo）的亲和力更高，进而信号响应更强，回算浓度偏高（以AOC药物本身作为标准曲线）。 偶联抗体分析 针对偶联抗体的分析，通常优先使用LBA平台。由于针对oligo抗体的关键试剂亲和力低并且特异性差，通常对于AOC oligo端的结合会采用非抗体亲和的方式。例如对于偶联siRNA AOC的生物分析，可以使用siRNA正义链标记生物素的AOC作为标准品，通过Avidin-HRP检测偶联抗体[6]。对于偶联ASO AOC的生物分析，相对简单一些，通常可以使用生物素标记的ASO互补链作为检测试剂，具体如下图所示： 图6. AOC药物偶联抗体ELISA检测形式示意图，A：siRNA偶联的AOC药物和B：ASO偶联的AOC药物的分析 值得注意的是，这样的分析方式也存在一些固有缺陷。例如，偶联siRNA AOC的偶联抗体分析需要使用标记生物素的AOC进行PK实验，虽然生物素标记在siRNA的正义链上，但无法排除其可能对药物吸收、分布和代谢的影响。此外，受限于检测形式，可能会高估OAR（Oligo Antibody Ratio）高的分子物种（molecular species）的浓度，造成偶联抗体定量不准确。 基于这些原因，在AOC药物生物分析中，更多采用定量偶联寡核苷酸和定量总抗体的方式来系统表征AOC药物体内ADME特征。 偶联/游离寡核苷酸分析 对于偶联寡核苷酸的分析，大致步骤上是先使用蛋白酶降解AOC，然后对siRNA或ASO本身进行分析。药明康德DMPK内部有成熟的LC-MS、Hybridization ELISA/MSD以及qPCR平台分析寡核苷酸，可以根据灵敏度以及检测代谢物等需求的不同，选择不同的分析平台。  （左右滑动，查看更多） 图7. AOC药物偶联寡核苷酸分析示意图 通常推荐使用Hybridization MSD平台来分析AOC偶联寡核苷酸。这种平台既能保证较好的灵敏度，又具有良好的方法稳健性和较宽的定量范围。以已上市siRNA药物Inclisiran为例，使用Hybridization MSD平台在猴血浆基质中定量检测反义链的线性范围为600pmol/L - 3pmol/L。下图展示了定量标准曲线以及标准曲线样品和质控样品的批间精密度/准确度计算结果，可见该方法具有良好的稳定性。 图8. 已上市siRNA药物Inclisiran使用Hybridization MSD方法分析的标准曲线以及精密度准确度评估 对于AOC药物游离寡核苷酸的分析，同样也是主要使用上述如上的分析平台。在进行DMPK研究时，考虑到AOC药物偶联寡核苷酸本身的摩尔量以及寡核苷酸系统循环快速清除的特征，检测游离寡核苷酸通常需要更高灵敏度的分析平台，特别是对于偶联稳定的AOC药物。 免疫原性分析 AOC药物的免疫原性考察与ADC药物类似，从风险角度上看，产生的ADA可能会结合到AOC药物的抗体部分、连接子或寡核苷酸部分，从而降低AOC药效。此外，形成的药物免疫复合物会被免疫细胞所摄取，在特定器官沉积，造成潜在的脱靶毒性风险。 普遍认为寡核苷酸免疫原性较低，对于寡核苷酸本身的清除影响很小，并且绝大部分产生的ADA是结合抗体而非中和抗体[7,8]。参考FDA的法规，寡核苷酸的研发和监管参考小分子药物ICH M3-R2进行，免疫原性在临床前阶段并非必须（但是NMPA通常建议考察或留样待测）。对于AOC药物而言，免疫原性的考察主要是针对其抗体部分，并且AOC药物免疫原性主要来源于其抗体部分。 AOC药物免疫原性评估主要包括对总抗药抗体（Total ADA）和中和抗体（Neutralization Antibody）的评估。总抗药抗体可采用桥接法或直接法检测（如图8所示），中和抗体可使用基于细胞或非细胞（配体竞争）的检测形式，值得注意的是，为了更全面的考察AOC药物的总抗药抗体，可以在IND申报阶段的方法学验证中同时考察加入AOC和裸抗的抑制率，以进一步明确抗药抗体针对的AOC药物区域，具体的AOC药物免疫原性评估流程如图9所示。 图9. AOC药物总抗药抗体分析检测形式示意图，A：ADA桥接法检测以及B：直接法检测 图10. AOC药物ADA评估流程图 生物标志物分析 AOC药物临床前生物标志物的分析包括寡核苷酸靶点相关分析（mRNA或其表达蛋白）、抗体靶点表达分析、免疫细胞反应分析、细胞因子分析、以及其他标志物分析等。生物标志物分析主要集中在对其药效和安全性的评估上，其中药效学评估涉及对寡核苷酸靶点相关的分析，包括通过qPCR平台进行靶点mRNA水平定量分析以及LBA平台进行表达蛋白定量分析。对于一些常见siRNA靶点，我们内部已经建立了靶点相关分析方法，可直接使用。安全性生物标志物评估主要包括对细胞因子释放和免疫细胞分型等相关研究，对于常见的免疫相关细胞因子和免疫细胞分型，我们已建立多种in-house方法以满足常规需求。同时，也可根据实际需求定制具体分析内容。 图11. AOC相关生物标志物分析示意图 结语 AOC药物因其良好的靶向性特征，大大的拓展了寡核苷酸的治疗领域与适应症，目前AOC药物的研发热情也在不断高涨。相对于传统的单抗和寡核苷酸药物，AOC作为复合药物其ADME、有效性以及安全性的研究内容相对更加复杂，涉及到的生物分析平台和策略也更多。考虑到AOC药物设计之间的差异，不同的AOC也需要为其量身定制合适的生物分析方法。 参考文献： [1] Qian, Linghui, et al. "The Dawn of a New Era: Targeting the “Undruggables” with Antibody-Based Therapeutics." Chemical Reviews (2023). [2] Song, Erwei, et al. "Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors." Nature biotechnology 23.6 (2005): 709-717. [3] Chang, Le, Jinming Li, and Lunan Wang. "Immuno-PCR: An ultrasensitive immunoassay for biomolecular detection." Analytica chimica acta 910 (2016): 12-24. [4] Mullard, Asher. "Antibody-oligonucleotide conjugates enter the clinic." Nat. Rev. Drug Discov 21.1 (2022): 6-8. [5] Dugal-Tessier, Julien, Srinath Thirumalairajan, and Nareshkumar Jain. "Antibody-oligonucleotide conjugates: a twist to antibody-drug conjugates." Journal of Clinical Medicine 10.4 (2021): 838. [6] Malecova, Barbora, et al. "Targeted tissue delivery of RNA therapeutics using antibody–oligonucleotide conjugates (AOCs)." Nucleic Acids Research (2023): gkad415. [7] Nanna, Alex R., et al. "Generation and validation of structurally defined antibody–siRNA conjugates." Nucleic Acids Research 48.10 (2020): 5281-5293. [8] Henry, Scott P., et al. "Assessment of the immunogenicity potential for oligonucleotide-based drugs." nucleic acid therapeutics 32.5 (2022): 369-377. [9] Dovgan, I., Koniev, O., Kolodych, S., & Wagner, A. (2019). Antibody–Oligonucleotide Conjugates as Therapeutic, Imaging, and Detection Agents. Bioconjugate Chemistry.  （下滑查看更多） 作者：周毛天，宋苗苗，马丽萍，邢丽丽 编辑：钱卉娟，袁萌 设计：倪德伟，张莹莹 药渡媒体商务合作 媒体公关 | 新闻&会议发稿 张经理：18600036371（微信同号） 点击下方“药渡“，关注更多精彩内容 免责声明 “药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！👇👇👇

▲10月26-27日成都中国临床试验产业发展大会免费报名 注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表平台立场。任何文章转载需得到授权。 2024年8月19日，致力于提供新型RNA疗法（抗体寡核苷酸偶联物AOCs™）的生物制药公司Avidity Biosciences宣布已完成先前宣布的8,418,000股普通股的承销公开发行，其中包括根据承销商完全行使其购买额外股份的选择权而出售的 1,098,000股，公开发行价为每股41.00美元。在扣除承销折扣和佣金以及其他发行费用之前，Avidity 从此次发行中获得的总收益约为3.451亿美元（约24.63亿元）。此次发行中出售的所有股份均由Avidity出售。 Avidity打算将此次发行的净收益，连同现有的现金、现金等价物和有价证券，用于资助其临床项目的开发，推进与其AOC平台相关的研发，以及用于营运资金和一般公司用途。 Avidity Biosciences利用其专有的抗体寡核苷酸偶联物平台(AOCs™)设计RNA疗法，将单克隆抗体的特异性与寡核苷酸疗法的精度结合起来，能够递送给以前无法达到的组织和细胞类型，以靶向以前RNA疗法无法治疗的疾病，并更有效地针对疾病的潜在遗传驱动因素。 该公司有三个临床阶段开发项目：AOC-1001用于治疗1型强直性肌营养不良症，AOC-1044用于治疗杜氏肌营养不良和AOC-1020用于治疗面肩肱型肌营养不良病。 8月，Avidity Biosciences宣布，在研抗体偶联寡核苷酸疗法delpacibart zotadirsen（del-zota），在适合接受外显子44跳跃疗法治疗的杜氏肌营养不良症（DMD44）患者中进行的1/2期临床试验EXPLORE44中获得积极数据。Del-zota显著提高患者抗肌萎缩蛋白的生产，最高达到了正常水平的54%。此外，del-zota使肌酸激酶水平下降至接近正常水平，与基线相比减少超过80%。Avidity公司表示，将与美国FDA展开讨论，寻求加速批准这一疗法的最佳途径。 2024年6月12日，Avidity公布了旗下AOC药物delpacibart braxlosiran（AOC 1020，del-brax）在面部肩关节肌营养不良(FSHD)患者中的1/2 期FORTITUDE™ 试验初步积极数据，将FSHD患者肌肉组织中DUX4调控基因平均减少超过50%；所有接受del-brax治疗的参与者受DUX4调节的基因减少了20%以上；新型循环生物标志物和肌酸激酶平均降低25%或更多Avidity计划2025年上半年启动关键三期临床试验。受此消息影响Avidity Biosciences当天股价大涨33%。 Avidity股价今年已经上涨401.66%，目前总市值53.17亿美元。 总结 AOC是一类抗体与寡核苷酸偶联合成的新型药物。通过将单抗和寡核苷酸偶联，达到有效的靶向治疗能力，具有精准靶向和更好的药代动力学特性。 目前全球布局AOC疗法的公司较少，除Avidity外，国外还有Tallac Therapeutics的TAC-001处于I/II期临床，Dyne Therapeutics的DYNE-101处于I/II期临床，Denali Therapeutics的DNL310处于II/III期临床，Gennao Bio的GMAB-7001处于临床前阶段。 国内AOC领域以伽进生物、民为生物、吉盛澳玛等企业正在针对DMD等疾病进行药物开发，其中迦进生物是国内首批从事小核酸偶联药物研发的生物科技公司，其抗体偶联PMO分子已经在临床前的DMD动物模型上取得了积极结果，单次给药后在mdx小鼠的腓肠肌中将全长dystrophin恢复到健康组织水平80%。 参考资料： https://aviditybiosciences.investorroom.com/2024-08-19-Avidity-Biosciences-Announces-Closing-of-Upsized-Public-Offering-of-Common-Stock,-Including-Full-Exercise-of-Underwriters-Option-to-Purchase-Additional-Shares 版权声明：本文转自细胞基因治疗前沿，如不希望被转载的媒体或个人可与我们联系，我们将立即删除 【关于药融圈】 药融圈PRHub旨在帮助生物医药科技型企业进行品牌推广及商务拓展服务，针对客户的真实需求制定系统化解决方案，通过“翻译-降维-场景化”将客户的品牌信息以直白易懂的方式被公众知悉，同时在流量渠道覆盖100万+垂直用户基础上实现合作目的，帮助合作伙伴完成从品牌开始到商务为终的闭环营销服务。我们已经完成了数十场线下1000人规模的生物医药研发类会议，涵盖小分子新药，大分子新药，改良型新药，BD跨境交易等多个领域，服务了百余家上市/独角兽/生物技术/制药企业。