在对抗SARS-CoV-2病毒引发的全球Covid-19大爆发的危局中发挥了关键作用的Paxlovid，其活性物质nirmatrelvir是一款3C样蛋白酶抑制剂（3C-like protease inhibitor, 3CLPRO，亦称Mpro），对于这个蛋白酶的抑制，在很大程度上阻断了病毒的复制过程，降低了感染者的重病率和死亡率。3C样蛋白是一个怎样的药物靶标，为何拿下了它就能赢得抗SARS-CoV-2的天王山之战？013C样蛋白酶名称来源3C样蛋白酶的正式名称为 C30 内肽酶（C30 endopeptidase）或 3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3-chymotrypsin-like protease，但这个名称并不是3C-like protease的词源）。[1]3C样蛋白的名称来源于3C蛋白酶（3CLpro）。3C蛋白酶（Picornain 3C ，EC 3.4.22.28) 是一种在小核糖核酸病毒中发现的蛋白酶，可切割非末端序列的肽键。至于简称，3CLPRO，顾名思义，来源于3C-like protease；而Mpro则产生于3C样蛋白酶的另一个名称Main protease（“主要蛋白”，在这篇文章中，我们选取Mpro作为它的简称）。023C样蛋白酶的结构特征SARS-CoV-2 Mpro通常为二聚体（图1），单体的平均分子量约为34.21 kDa。Mpro单体由三个结构域组成：包括结构域 I、结构域 II 和结构域 III（图2）。[2]结构域 III 是一个额外的螺旋结构域， 它的聚集引发了 Mpro的二聚化，从而产生了成熟的二聚体结构。[3]Mpro单体的酶促活性较低， 但Mpro的单体通常是一种瞬态，其二聚体易形成且有显著升高的活性。[4]结构域 I (Phe8−Tyr101) 和结构域 II (Lys102−Pro184) 是催化结构域，并且具有反平行的β-barrel结构; 而结构域 III (Thr201−Val303)包含五个 α-螺旋，并有助于单体的二聚化。[5]结构域 II和 III 由一个柔性的环形区域连接（Phe185−Ile200)。[6]图1. SARS-CoV-2 Mpro（二聚体）的3D结构。（图片来源：Science）图2. SARS-CoV-2 Mpro单体结构域示意图。（图片来源：MedComm.2022;3:e151）033C样蛋白酶在病毒复制过程中的功能SARS-CoV-2是一种具有正链大 RNA 基因组的包膜 β 冠状病毒。[7]尽管 SARS-CoV-2 具有约 30 kb 的大型 RNA 基因组，但它仅编码少量蛋白质。在这些少量的蛋白质中，半胱氨酸蛋白酶 Mpro 介导病毒复制过程中多蛋白的成熟裂解。[8]此外，它在病毒进入宿主细胞方面也发挥着重要作用。[9]病毒的生命周期，始于病毒的 S 蛋白（刺突蛋白，亦称S糖蛋白）与其在宿主细胞上的受体 ACE2（血管紧张素转换酶-2）的结合（图2）。结合之后，病毒包膜与宿主细胞膜融合，病毒基因组释放到宿主细胞的细胞质中。[10]图3. SARS-CoV2病毒刺突蛋白与ACE2（血管紧张素转化酶2）受体蛋白结合示意图（图片来源：University
of California, Berkeley; Istanbul Technical University）在入侵宿主细胞后，病毒基因组(+ssRNA) 劫持宿主核糖体，并翻译成分子量大约为800KDa大多肽 (PP) 链。新生成的 PP 链并不具有直接的生物活性，而是需要首先被病毒基因组编码的两种蛋白酶，即木瓜蛋白酶样蛋白酶 (PLpro) 和 3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶 (3CLpro，或称Mpro) 自动水解切割，以生成病毒复制所需的几种非结构蛋白(NSP，non-structural proteins) 。3CLpro也称为主要蛋白酶（Mpro），在病毒复制中起主要作用。PLpro和 Mpro将 PP链切割成 16 个 NSP：在生成的 16 个 NSP 中，Mpro生成了 11 个 NSP，这使得该蛋白酶成为开发抗SARS-CoV 药物的主要靶标。[11]另一方面，结构蛋白和其他辅助蛋白是通过称为亚基因组 (Sg，sub-genome) 翻译的独特机制生成的。Sg 是通过反义病毒 RNA的 5' 端的不连续转录产生的。[12]基因组复制和翻译成功后，NSP、结构蛋白和辅助蛋白与正义病毒 RNA 基因组一起组装形成新的病毒粒子，并入侵新的宿主细胞，引发新一轮的病毒干扰与复制。04Mpro蛋白酶的底物特征和催化过程Mpro蛋白酶从作用方式来看，归属于半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease）家族。所谓半胱氨酸蛋白酶，指的是酶蛋白的催化三联体（triad）或二联体（dyad）中，起水解催化作用的是半胱氨酸。它的巯基侧链进攻底物，催化其水解过程。具体到Mpro半胱氨酸蛋白酶，它具有一个组氨酸41-半胱氨酸145二联体，[13]切割含有Gln-(Ser/Ala/Gly)二肽结构底物的肽键（酰胺键）。其中组氨酸侧链的咪唑基团起到碱基的作用，而半胱氨酸侧链的巯基作为亲核基团进攻底物的酰胺键，并最终导致该酰胺键的巯基-催化水解。3C 样蛋白酶能够催化水解位于P1 位的氨基酸Gln (谷氨酰胺) 与 P1' 位的位阻较小的氨基酸（即Ser丝氨酸、Ala丙氨酸，或Gly甘氨酸）之间的肽键（即Gln-Ser, Gln-Ala, Gln-Gly肽键）。在催化水解多肽底物的过程中，SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶上的His41-Cys145二联体协同作用。His首先充当general base催化剂，其侧链的咪唑碱性基团夺取了Cys侧链巯基上的氢，使后者通过失质子作用转化为亲核性更强的巯基阴离子。巯基阴离子因此亲核进攻与SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶结合的底物的主链酰胺键-Gln-Xaa-(Xaa=Gly, Ala, Ser等)，产生了一个新的Gln-硫酯产物，并释放H-Xaa-多肽，作为水解的一个产物。因为硫酯不稳定，易发生水解，因此Gln-硫酯在水解后形成了第二个水解产物多肽-Gln-OH，并再生了Cys145侧链巯基。整个过程即-Gln-Xaa-(Xaa=Gly, Ala, Ser等) 的水解，His充当general base催化剂，Cys为亲核催化剂。这个酶催化水解过程在Scheme 1中显示。Scheme 1. SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶催化底物-Gln-Xaa-水解过程。SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶上存在编号为 S1、S1'、S2 和 S3 的结合口袋，用于容纳内源型肽底物肽的 P1、P1'、P2 和 P3 残基。[14] P1’为多肽底物待切割肽链C端的官能团（或者C端氨基酸残基的侧链），与S1’结合口袋作用；P1是多肽底物待切割肽链N端氨基酸残基侧链的官能团（通常为谷氨酰胺Gln侧链的酰胺基团，与S1结合口袋作用）；P2是P1（Gln）的N端氨基酸残基的侧链（与S2结合口袋作用），P3是P2的N-端氨基酸残基侧链（与S3结合口袋作用）。SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶与底物结合示意图见图3。图3. SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶结合口袋与底物结合示意图。（图片来源：Computational and Structural
Biotechnology Journal）研究人员发现，SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶S1 和 S2 是最具选择性的。上文提及，S1 专门结合 Gln，而 S2 更喜欢中等大小的疏水残基，如 Leu 或 Phe。[15]我们都已经知道，最终成功撞线的SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶抑制剂是nirmatrelvir，它的化学结构以及受体结合见图4。图4. SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶抑制剂nirmatrelvir化学结构，以及受体结合示意图。它的最显著的特点，在于P1’位被一个氰基（cyano group）所占据，因此它具有共价药物的明显特征。氰基为一个较为温和的亲电基团，在共价药物中充当与受体结合的“弹头”（warhead）角色。具体到SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶，它可以与S1’结合为的Cys残基，也就是在Mpro蛋白酶水解底物的His41-Cys145二联体中的Cys145。由于这个氰基取代了Mpro蛋白酶天然底物（即SARS-CoV-2病毒生成的PP多肽）中的-Gln-Xaa-主链酰胺键（肽键），因此它替代天然底物成为了Cys145巯基亲核进攻的目标。而氰基与巯基之间的共价反应产生了新的硫代亚胺酸酯（thioimidate）结构（图5）。通过这个共价反应，nirmatrelvir共价绑定了SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶，从而使其失去了水解病毒蛋白底物的能力，阻止了病毒复制的关键步骤。这正是nirmatrelvir成功的地方：即高效的非共价结合，加上特异的共价反应，精准地打击了Mpro蛋白酶最重要的Cys145而使其失去生物活性。至于P1位置是一个吡咯烷酮的内酰胺，而非Gln，也是出于氰基的影响而考虑的。因为Gln的侧链酰胺具有较弱的亲核性，会介导分子内对氰基的亲核进攻而使得药物降解，因此研发人员用一个吡咯烷酮的类似物类替代Gln酰胺，显著抑制了分子内环化的降解，提高了nirmatrelvir的化学稳定性。图5. 巯基化合物与腈类化合物产生硫代亚胺酸酯的反应。总结这篇文章介绍了在SARS-CoV-2病毒复制过程中起关键作用的3C样蛋白酶的特征，包括其结构和生物学功能，并且在这些基础上了解了它的蛋白酶抑制剂设计，以及抑制剂nirmatrelvir在抗SARS-CoV-2病毒过程中的药理学原理。由于Mpro蛋白酶在冠状病毒中的保守性，在这个领域内加深的认识，有可能帮助人们研发出更有效安全的广谱抗病毒药物，这一点对于未来全球的公共卫生事业无疑意义重大。参考文献：[1] Ahmad, B. et al. Exploring the Binding Mechanism of PF-07321332
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