普渡大学的研究人员近日在《细胞报告》杂志上发表论文，首次报道了具有强大抗肿瘤活性的CAR-中性粒细胞，而且细胞来自多能干细胞分化而来。这是继CAR-T，CAR-NK，CAR-巨噬细胞后的第四种CAR修饰免疫细胞。中性粒细胞是外周血中最丰富的白细胞，能有效地跨越生理屏障进入实体瘤，在肿瘤组织中含量也很高。在过去的十年中，嵌合抗原受体（CAR）被用于T细胞和自然杀伤细胞（NK）细胞以增强其抗肿瘤作用。最近发现，CAR-巨噬细胞的抗肿瘤效应也大大提高，包括其吞噬功能。考虑到中性粒细胞与巨噬细胞的相似性和共同的先天抗肿瘤反应，CAR工程后，中性粒细胞也可能表现出增强的杀瘤活性。普渡大学戴维森化学工程学院助理教授Xiaoping Bao介绍，中性粒细胞从供体分离后，很难在体外扩增到足够数量以供输注。而且中性粒细胞很难进行基因修饰，且存活期短。在这里，研究者开发了一个平台，通过特异性信号调节分子，从人类多能干细胞（hPSCs）中稳定诱导生成中性粒细胞。通过CRISPR-Cas9介导的同源重组技术将3种不同的胶质母细胞瘤（GBM）靶向CAR敲入hPSCs中，比较它们改善中性粒细胞介导的肿瘤杀伤的能力。他们发现由组成的CLTX-T-CAR在增强hPSC衍生中性粒细胞的抗肿瘤细胞毒性方面效果最佳。CLTX是一种36个氨基酸的GBM靶向肽，发现于蝎毒中。CAR的其他机构包括CD4跨膜结构域和CD3ζ胞内结构域。诱导生成的CLTX-T-CAR中性粒细胞具有典型的中性粒细胞表型，并通过膜相关基质金属蛋白酶2（MMP2）与GBM特异性结合后杀死肿瘤细胞。与野生型中性粒细胞、NK细胞和CAR NK细胞相比，体内注射后CLTX-T-CAR中性粒细胞在原位GBM异种移植模型中显著抑制肿瘤生长，延长动物存活时间。Bao开发了从人类多能干细胞（hPSCs）中大规模生产CAR中性粒细胞的方法。CAR在hPSCs表面表达后通过一种新的方法将其诱导为功能性CAR中性粒细胞。研究显示来源于hPSC的CAR-中性粒细胞对胶质母细胞瘤显示出优异的特异性抗肿瘤活性。造血祖细胞诱导是从hPSCs产生中性粒细胞的第一步。造血干细胞和祖细胞（HSPC）来源于主动脉-性腺-中肾（AGM）区域的动脉血管，通过内皮-造血转化（EHT）生成HSPC。通过小分子激活Wnt信号后从hPSCs诱导出CD34+CD31+造血内皮细胞（HE）。由此产生的HE表达SOX17，这是一种在AGM血管结构中表达的转录因子，是产生HSPC所必需的。转化生长因子β（TGFβ）抑制剂SB431542（SB）进一步促进EHT产生CD45+CD43+HSPC（图1）。具体来说，为了制备髓系祖细胞，从第9天起，用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-3（IL-3）和IL-6处理hPSC衍生的HSPC。在不同天收集的髓系祖淋巴细胞呈现GM和巨噬细胞（M）集落形成潜能，从第12天到第18天增加，随后降低。为了诱导中性粒细胞，用G-CSF处理第15天的髓系祖细胞。中性粒细胞的分化效率从第15天增加到第21天，之后显著降低，可能是由于中性粒细胞寿命短的原因。所得的中性粒细胞显示出典型的中性粒细胞核形态（图1），高表达中性粒细胞标记物，包括CD16、CD11b、CD15、CD66b、CD18和MPO。图1 多能干细胞-造血干细胞中性粒细胞的分化过程。为了评估hPSC衍生的中性粒细胞的功能，他们进行了吞噬和趋化试验。与外周血（PB）中性粒细胞类似，hPSC衍生的细胞有效吞噬大肠杆菌颗粒pHrodo，并显示出优异的迁移能力。在佛波醇12肉豆蔻酸13醋酸盐（PMA）刺激下，hPSC衍生的中性粒细胞产生的活性氧（ROS）量与PB中性粒细胞相当。为了在中性粒细胞上实现稳定和均匀的CAR表达，他们通过Cas9介导的同源重组将CAR基因敲入hPSCs中的AAVS1位点。使用T或NK细胞特异性激活域设计了三种不同的抗GBM CAR：CLTX-T-CAR、IL-13受体α2（IL-13Rα2）靶向的四重突变体IL-13（TQM13）T-CAR（IL13-T-CAR）和CLTX-NK-CAR。在中性粒细胞分化过程中，RT-PCR分析和流式细胞术分析证实了hPSCs上稳定的CAR表达（图2）。图2 CAR的结构。与野生型hPSC衍生或PB中性粒细胞相比，CAR中性粒细胞具有更好的肿瘤杀伤能力。在不同的CAR组中，CLTX-T-CAR中性粒细胞显示出优越的肿瘤杀伤活性。中性粒细胞释放细胞毒性ROS来杀死靶细胞，不同中性粒细胞产生ROS的动力学与它们增加的肿瘤杀伤能力一致，表明ROS参与中性粒细胞介导的肿瘤杀伤。此外，在CLTX-T-CAR中性粒细胞和GBM细胞的共孵育中观察到增强的抗肿瘤细胞毒性，但与其他癌细胞的共培养没有观察到，表明它们对GBM具有高度特异性。值得注意的是，CLTX-T-CAR中性粒细胞不能杀死正常的hPSC、hPSC衍生细胞或非肿瘤胶质细胞（图3）。中性粒细胞和肿瘤细胞之间的免疫突触在共培养30分钟后形成，并随培养时间成比例增加。正如预期的那样，与PB和hPSC中性粒细胞相比，在CLTX-T-CAR中性粒细胞和肿瘤细胞之间观察到更多的效应-靶相互作用，而CAR中性白细胞和正常hPSC、hPSC衍生细胞或非肿瘤神经胶质细胞之间未形成免疫突触，突出了它们对肿瘤细胞的特异性。图3 CAR-中性粒细胞和肿瘤结合。为了进一步评估CAR中性粒细胞的活性，他们使用人脑微血管内皮细胞建立了基于transwell的血脑屏障（BBB）模型。尽管表达CAR的中性粒细胞和野生型中性粒细胞对N-甲酰蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸（fMLP）的反应显示出类似的跨BBB迁移活性，但CAR中性粒细胞在迁移后显示出更高的肿瘤杀伤能力。此外，在3D GBM模型，与野生型对照组相比，在3D肿瘤模型中，CLTX-T-CAR中性粒细胞显示出更高的肿瘤浸润性，并且在缺氧（3%O2）和常氧（21%O2）条件下均具有肿瘤杀伤作用（图4,5）。图4 体外模型显示CAR-中性粒细胞穿过血脑屏障模型。图5 体外肿瘤3D模型显示CAR-中性粒细胞进入肿瘤组织为了确定CLTX-T-CAR中性粒细胞在体内的功能，他们通过颅内注射荧光素酶表达的GBM细胞建立原位异种移植模型。通过瘤内或静脉注射中性粒细胞来测定其体内抗肿瘤活性，并与来源于hPSC的NK细胞进行比较。在体外，CLTX-T-CAR中性粒细胞比CLTX-NK-CAR NK细胞更有效地杀死GBM细胞，并且未观察到CAR中性白细胞和CAR NK细胞之间的组合效应。在瘤内注射实验中，荷瘤小鼠在肿瘤细胞接种后3小时给予单剂量PBS或hPSC衍生细胞。在第3天首次成像后，每周进行生物发光成像（BLI）以监测肿瘤生长。与PBS相比，使用hPSC衍生的中性粒细胞或NK细胞治疗可显著降低肿瘤体积（图6）。图6 动物模型显示CAR-中性粒细胞的抗肿瘤活性。总之，研究者创见的CAR中性粒细胞工程平台可以作为一种可扩展的策略，使中性粒细胞成为抗癌症的标准化细胞产品。鉴于HPSC中的基因编辑相对容易，还可以进行其他基因修饰，如多个CAR表达。由于中性粒细胞本身具有穿过BBB和穿透脑实质的能力，非常适合GBM的治疗。参考资料：1.Yun Chang, Ramizah Syahirah, Xuepeng Wang,
Gyuhyung Jin, Sandra Torregrosa-Allen, Bennett D. Elzey, Sydney N. Hummel,
Tianqi Wang, Can Li, Xiaojun Lian, Qing Deng, Hal E. Broxmeyer, Xiaoping Bao.
Engineering chimeric antigen receptor neutrophils from human pluripotent stem
cells for targeted cancer immunotherapy. Cell Reports, 2022; 40 (3): 111128
DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111128近期热门视频更多精彩视频，尽在佰傲谷视频号，欢迎关注~本周好文推荐如需转载请联系佰傲谷并在醒目位置注明出处﹀ 点亮在看，传递信息♥
