ATR inhibitors(Easton)

引言在与癌症这场艰苦的战斗中，我们不仅要面对细胞染色体（chromosomal DNA）中基因的变异，还得警惕癌细胞藏着一个“秘密武器”——游离在外的环状DNA，称之为extrachromosomal DNA (ecDNA)。这些“脱缰”的DNA就像是癌细胞里的“加速器”，能够大量扩增致癌基因（oncogenes），赋予癌细胞超强的生长、适应和逃避治疗的能力，让它们像“打不死的小强”一样难以根除。ecDNA的存在，是许多肿瘤预后不良、治疗耐药的重要原因。然而，这些没有着丝粒（centromeres）的ecDNA，它们是如何在细胞分裂的混乱中保持稳定，并不断复制和传递的？这其中的分子机制一直是一个充满挑战的谜题。它们会不会给细胞带来什么“麻烦”？细胞又会如何应对这些特殊的DNA分子？4月28日一项发表在《Cell》上的重磅研究“Extrachromosomal DNA replication and maintenance couple with DNA damage pathway in tumors”，为我们揭开了这个谜底的一部分，而且发现异常惊人！这项研究通过构建含有ecDNA的细胞模型，深入探究了ecDNA的命运。研究人员发现，ecDNA在细胞内的复制和转录活动，竟然会持续地引发DNA损伤——特别是DNA双链断裂（DSBs），进而激活细胞自身的DNA damage response (DDR)（DNA损伤反应）通路。更令人意想不到的是，ecDNA要想在细胞里长期稳定存在，恰恰需要依赖细胞的DDR通路来修复它自己造成的损伤！尤其是alt-NHEJ（替代性非同源末端连接）这一特殊的DNA修复路径，被证明是ecDNA维护的关键“保镖”。这种ecDNA与细胞DDR通路之间奇妙的“相爱相杀”关系，彻底颠覆了我们以往的认知，也为对付携带ecDNA的顽固肿瘤提供了全新的视角。这意味着，如果我们能找到方法干扰或破坏ecDNA对DDR的这种“借力”，我们或许就能切断ecDNA的生存线索，从而有效地打击那些最难缠的癌细胞。这项研究不仅揭示了ecDNA复制维护背后的核心机制，更指明了潜在的治疗靶点，为开发全新的抗癌疗法带来了希望曙光。癌症里的“暗物质”：ecDNA的复制与维持之谜故事的主角是来自一项利用CRISPR-C技术构建ecDNA模型的突破性研究。CRISPR-C技术就像一把能够精确剪切DNA的分子剪刀，研究人员巧妙地利用它，在人类胶质母细胞瘤来源的U251细胞和人胚胎肾来源的293T细胞中，靶向EGFR基因（在很多胶质母细胞瘤中高表达，且常位于ecDNA上）的上下游区域，制造DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs），诱导断裂的两端重新连接（end-joining），从而成功地在这些细胞中生成了含有EGFR基因的环状ecDNA（ecDNA+细胞）。为了确认这些环状DNA确实是游离的ecDNA，而不是染色体上串联重复（tandem duplications）产生的假象，研究人员进行了一系列验证。他们通过FISH (Fluorescence in situ hybridization)技术观察了细胞分裂中期的图像。在野生型U251细胞中，EGFR基因的信号与代表7号染色体的CEN7信号是共定位的，都在染色体上。但在新生成的ecDNA+ U251细胞中，EGFR信号明显与7号染色体分离，并且在细胞核中形成了游离的焦点（foci），数量显著高于ecDNA-细胞（P = 0.000096）。这直接证明了EGFR基因已经从染色体上脱离，形成了ecDNA。在另一种ecDNA模型——来自同一患者的结直肠癌细胞系COLO320DM（ecDNA上MYC基因扩增）和COLO320HSR（染色体上MYC基因扩增）中，也观察到了类似的结果。ecDNA既然能在细胞里“作妖”，就必须能自我复制。研究人员使用EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)——一种可以标记新生DNA的分子，通过EdU-FISH方法进行检测。他们在U251 ecDNA+细胞中看到了EdU信号与EGFR FISH信号的共定位，这清晰地表明，ecDNA正在这些细胞中积极地进行复制。COLO320DM细胞也显示了类似的复制能力。更令人惊讶的是，这些ecDNA在细胞内可以相当稳定地存在。通过qPCR检测，研究人员发现在构建的U251和293T ecDNA+细胞模型中，相对EGFR拷贝数在长达60天的培养过程中都保持稳定，甚至略有增加。尽管这些模型中单个细胞携带的ecDNA数量可能低于体内肿瘤细胞，但这种稳定性已经足以支持对其维持机制的研究。能自我复制的“脱缰野马”？ecDNA的顽强生存术ecDNA既然能稳定存在并复制，那么细胞是如何维持它们的呢？这背后必然有复杂的分子机制在运作。研究人员采用了EdU-labeled immunoprecipitation (EdU-IP)结合Mass Spectrometry (MS)的方法，来“钓取”与新生DNA相关联的蛋白质。简单来说，就是在细胞合成新DNA时用EdU标记，然后将这些被标记的DNA连带与它们结合的蛋白质一起“拉”出来，再用质谱仪鉴定这些蛋白质。结果发现，这个方法成功富集到了很多已知与DNA复制相关的蛋白质，证实了其有效性。更重要的是，在ecDNA+细胞中，有大量蛋白质显著富集，其中不仅包括了MCM2和POLD等DNA复制关键蛋白，提示ecDNA+细胞的DNA复制活动更旺盛，还鉴定出了在所有三种ecDNA+细胞系（U251ecDNA+, 293TecDNA+, COLO320DM）中都富集的686种蛋白质，以及在至少两种ecDNA+细胞系中富集的1537种蛋白质。对这些富集蛋白进行Gene Ontology (GO)分析，发现它们显著富集在与DNA复制和DNA repair（DNA修复）相关的生物学过程。具体来看，包括Mismatch repair (MMR)、Base-excision repair (BER)、Nucleotide excision repair (NER)和DSB repair（DNA双链断裂修复）等关键DNA修复通路都赫然在列。这提供了第一个重要线索：ecDNA的维持和复制，与细胞的DNA损伤反应（DDR）通路密切相关。一边复制一边“惹祸”：ecDNA引发细胞的报警信号既然ecDNA与DNA损伤修复相关，那么ecDNA的存在是否会导致细胞内的DNA损伤水平升高呢？研究人员检测了DNA损伤的标志物——磷酸化H2AX (γH2AX)，这是DSBs附近的组蛋白变体。结果非常明确：在多对ecDNA+/ecDNA-细胞模型中，ecDNA+细胞中的γH2AX水平都显著高于对应的ecDNA-细胞。例如，在U251 ecDNA+细胞中，细胞核中γH2AX焦点（foci）数量超过5个的细胞比例显著高于ecDNA-细胞（P = 0.0002）；在COLO320DM细胞中，这一比例也显著高于COLO320HSR细胞（P = 5.56e-15）。进一步，他们通过FISH-IF技术观察γH2AX焦点与ecDNA的共定位。在ecDNA+细胞中，γH2AX焦点能够与ecDNA（通过MYC或EGFR探针标记）焦点发生共定位，这直接证明了损伤就发生在ecDNA上。为了更全面地了解DSBs在ecDNA上的分布，研究人员使用了END-seq技术，这是一种可以在核苷酸分辨率上检测DSBs的技术。分析COLO320DM细胞的END-seq数据发现，鉴定到的DSB峰（peaks）中有很高比例（约66%）位于环状DNA区域（即ecDNA）。并且，这些DSB在ecDNA上的分布并不是随机的，它们在启动子区域（promoter region）的富集程度显著高于内含子（introns）和外显子（exons）等其他DNA元件，提示ecDNA上的DSBs可能优先发生在脆弱位点（fragile sites）。γH2AX水平升高通常意味着DSBs的发生，并激活DNA损伤反应通路。DDR通路的激活通常由DNA损伤感受器（sensors）启动，并通过激酶（kinases）传递信号，如ATM (ataxia telangiectasia mutated)和ATR (ataxia telangiectasia and Rad3-related protein)。研究人员检测了这些激酶及其下游效应器的磷酸化水平。虽然总的ATM和CHK2（ATM下游激酶）蛋白水平在ecDNA+/ecDNA-细胞间没有显著差异，但磷酸化的ATM (p-ATM)和磷酸化的CHK2 (p-CHK2)水平在ecDNA+细胞中显著升高。这证实了ATM介导的DDR通路在ecDNA+细胞中被激活。相对而言，总的CHK1（ATR下游激酶）和磷酸化的CHK1 (p-CHK1)水平则没有显示出一致性的改变。这些细胞水平的结果，也在临床肿瘤样本数据中得到了印证。通过分析包含14种癌症类型、3362个样本的TCGA数据库（TCGA dataset），研究人员发现ecDNA+肿瘤样本的DDR得分（使用GSVA方法计算，反映DDR相关基因的整体表达水平）显著高于ecDNA-肿瘤样本。在胶质母细胞瘤（GBM）、低级别胶质瘤（LGG）和乳腺癌（BRCA）等特定癌症类型中，ecDNA+样本也普遍具有更高的DDR得分。所有这些数据都强烈指向一个结论：ecDNA的复制和维持过程会在ecDNA本身引发DSBs，并激活以ATM为主导的DNA损伤反应通路。“拓扑异构酶”：ecDNA复制维护中的关键“刹车”和“油门”那么，ecDNA上的DSBs究竟是如何产生的呢？研究人员推测，这可能与细胞内部的一些分子因素有关，特别是那些调控DNA拓扑结构的酶——topoisomerases（拓扑异构酶）。由于ecDNA是环状的，其复制和转录会引入额外的超螺旋（supercoiling）和缠结，这些拓扑约束需要拓扑异构酶来解除。当拓扑异构酶的活性受阻时，会形成共价连接的中间产物——topoisomerase cleavage complexes (TOPCCs)，这些TOPCCs如果不能被及时解除，就会导致DNA断裂。原文中提到的TOP2B在ecDNA+细胞富集蛋白列表中被一致鉴定到，且在ecDNA+细胞中的蛋白水平显著高于ecDNA-细胞，Western blot也证实了这一点。研究人员通过shRNA敲低（knockdown）TOP2B或其家族成员TOP2A，发现敲低TOP2B能够显著降低ecDNA+细胞中的γH2AX信号，比如在PC3+细胞中，细胞核中γH2AX焦点数量超过5个的细胞比例从shNC的60%显著降低到了shTOP2B的20%（P < 0.0001）；在U251 ecDNA+细胞中，这一比例从shNC的60%显著降低到了shTOP2B的10%（P = 5.56e-15）。这表明TOP2B是ecDNA诱导DDR的关键调控因子。而敲低TOP2A的效果则不如TOP2B显著。拓扑异构酶家族还包括TOP1等。TOP1也被发现在ecDNA+细胞的富集蛋白列表中。敲低TOP1同样显著降低了ecDNA+细胞中的γH2AX信号，包括总的γH2AX信号和ecDNA上的γH2AX信号（例如，在PC3+细胞中，细胞核中γH2AX焦点数量超过5个的细胞比例从shNC的60%显著降低到了shTOP1的20%（P < 0.0001））。为了直接证明TOP1在ecDNA上的存在，研究人员在携带ecDNA并表达TetR-EGFP蛋白的PC3细胞（TetO-eGFP PC3 (+)）中进行了in situ proximity ligation assay (PLA)。这种技术可以在细胞内检测两个蛋白质分子是否非常接近。他们用针对TOP1和TetR（TetR结合在ecDNA上）的抗体进行PLA，结果在ecDNA焦点位置观察到了共定位的PLA信号。当加入强力霉素（doxycycline，一种可以解除TetR与DNA结合的药物）后，PLA焦点数量显著减少（P=4.51e-3），证实了TOP1确实定位于ecDNA上。进一步，他们检测了TOP1CCs的水平。结果显示，ecDNA+细胞中的TOP1CCs水平显著高于ecDNA-细胞，并且这些TOP1CCs可以定位于ecDNA上。敲低TOP1后，TOP1CCs在ecDNA上的富集也显著减少。这些发现提示，TOP1和TOP2B都可能是在ecDNA复制或转录过程中产生DSBs的重要来源，它们在ecDNA复制和维护介导的DDR通路中扮演着关键角色。“另辟蹊径”的修复部队：ecDNA维护依赖的特殊路径细胞为了维持基因组的稳定，会动员DSB修复通路来修复DNA断裂。主要的DSB修复通路包括Homologous Recombination (HR)、NHEJ和alternative non-homologous end joining (alt-NHEJ)。有趣的是，alt-NHEJ特有的DNA连接酶LIG3在ecDNA+细胞富集蛋白列表中也被鉴定到。这强烈暗示了ecDNA的维持可能特别依赖于DDR通路，尤其是alt-NHEJ。为了验证这一猜想，研究人员通过shRNA或抑制剂敲低了不同DDR通路的关键组分。他们发现，敲低LIG1（NHEJ和BER通路中关键连接酶）或LIG4（NHEJ通路特有的连接酶）并没有显著影响ecDNA水平（例如，在COLO320DM细胞中，敲低LIG1或LIG4后，分裂中期ecDNA数量与对照组shNC相比没有显著差异）。然而，短暂或稳定敲低LIG3却显著降低了ecDNA水平（例如，在COLO320DM细胞中，稳定敲低LIG3后，分裂中期ecDNA数量显著低于shNC组，P < 0.0001）。通过过表达LIG3可以部分挽救ecDNA的丢失，但过表达失去连接酶活性的LIG3突变体则不能，这表明LIG3的连接酶活性对于维持ecDNA水平至关重要。同时敲低LIG1和LIG3，ecDNA水平下降得更加明显（显著低于单独敲低LIG3，P = 0.00049），提示LIG3在ecDNA维持中可以补偿LIG1的功能，但LIG1不能补偿LIG3。进一步的实验发现，抑制LIG3会增加线性DNA片段的积累（用核酸外切酶Exo V处理细胞DNA后，在siLIG3处理的COLO320DM细胞中，EGFR基因的线性DNA片段条带显著增加），这提示LIG3可能参与了将线性片段重新连接成环状ecDNA的过程。此外，敲低LIG3也导致ecDNA拷贝数和γH2AX水平显著下降（如siLIG3 COLO320DM细胞的MYC拷贝数显著下降，而细胞核中>5个γH2AX焦点的细胞比例显著升高）。PLA实验也证实了LIG3定位于ecDNA上。这些结果一致表明，LIG3在ecDNA的复制和维持中起着重要作用。LIG3是alt-NHEJ通路的关键组分。研究人员继续敲低或抑制了其他与alt-NHEJ相关的关键因子，包括POLQ（DNA聚合酶θ）、CtIP、PLK1、FEN1和XRCC1等。结果发现，抑制POLQ显著降低了ecDNA水平（POLQi处理COLO320DM细胞后，分裂中期ecDNA数量显著减少，P < 0.0001）。敲低CtIP、PLK1、POLQ、FEN1和XRCC1等alt-NHEJ组分也显著降低了ecDNA水平。通过FISH和PLA实验，研究人员进一步证实了这些alt-NHEJ组分都定位于ecDNA上，并且抑制上游的alt-NHEJ因子（如PARP抑制剂Olaparib或PLK1抑制剂Volasertib）会降低下游因子（如LIG3和POLQ）在ecDNA上的定位。此外，研究发现在细胞分裂期（mitosis），ecDNA+细胞比ecDNA-细胞含有更多的γH2AX信号（显著更高，P=4.01e-24），这表明在细胞分裂期，ecDNA仍然存在损伤。抑制alt-NHEJ组分（如POLQ或PLK1）会显著增加有丝分裂期ecDNA+细胞的γH2AX水平（POLQi或PLK1i处理后，COLO320DM有丝分裂期细胞的γH2AX焦点数量显著增加，P < 0.0001），LIG3 siRNA在有丝分裂期也增加了ecDNA上的γH2AX信号。MDC1是另一个与alt-NHEJ功能相关的蛋白，敲低MDC1也显著降低了ecDNA水平。所有这些证据都强烈支持一个结论：ecDNA的维护主要依赖于alt-NHEJ通路。这些在ecDNA复制过程中产生的、甚至持续到有丝分裂期的DSBs，主要通过alt-NHEJ进行修复。修复不好，ecDNA就“散架”？DDR通路对ecDNA环化的重要性那么，DDR通路是如何确保ecDNA的维持的呢？研究人员推测，DDR通路可能对于ecDNA的环化（circularization）至关重要。ecDNA在复制扩增过程中可能会产生线性的中间产物，这些线性片段需要通过DSB修复通路重新连接成环状，才能维持ecDNA的完整性和稳定性。研究人员通过Exo V酶切实验（该酶可以降解线性DNA但不能降解环状DNA）检测了线性ecDNA片段的水平。他们发现，用ATM抑制剂（ATMi）处理ecDNA+细胞后，线性EGFR片段在Exo V处理后的条带显著增加，这表明抑制ATM损害了ecDNA的环化过程。综合来看，研究揭示了ecDNA维持与DDR通路之间的reciprocal interaction（相互作用）：ecDNA的复制和转录活动引发DSBs并激活以ATM为中心的DDR通路；而DDR通路（特别是alt-NHEJ）则通过修复这些DSBs，确保ecDNA能够维持环状结构并稳定存在。对付ecDNA，试试“釜底抽薪”：靶向DDR通路的新希望鉴于拓扑异构酶是DSBs的来源，而DDR通路是ecDNA维持的关键，那么靶向这些通路是否能有效地对付携带ecDNA的肿瘤细胞呢？研究人员首先验证了敲低TOP1或TOP2B会显著减少ecDNA水平（例如，COLO320DM细胞中，敲低TOP1或TOP2B后，分裂中期ecDNA数量显著减少，并伴随染色体HSR信号的增加，P < 0.0001）。接着，他们用ATM抑制剂（ATMi，如KU55933）和CHK2抑制剂（CHKi，如AZD7762）处理ecDNA+细胞。结果非常惊人：大多数ecDNA焦点消失了，并形成了HSRs（染色体上的同质着色区，通常是线性DNA整合到染色体上的表现），ecDNA拷贝数也显著下降（MYC拷贝数显著下降，P = 3.46e-4）。而ATR抑制剂（ATRi）则没有这个效果。更令人振奋的是，ecDNA+细胞对ATM抑制剂、CHK2抑制剂和TOP1抑制剂显示出更高的敏感性。在多个细胞系中进行的药物敏感性实验表明，与相应的ecDNA-细胞相比，ecDNA+细胞对ATMi、CHKi和TOP1抑制剂（CPT）的IC50值（半数抑制浓度）显著降低。例如，COLO320DM细胞对ATMi的敏感性显著高于COLO320HSR（IC50显著降低）；U251 ecDNA+细胞对ATMi和CHKi的敏感性也显著高于U251 ecDNA-细胞；PC3+细胞对ATMi、CHKi和CPT的敏感性显著高于PC3-细胞；HT-29 MTX细胞对ATMi和CHKi的敏感性显著高于HT-29细胞。这为治疗携带ecDNA的肿瘤提供了新的治疗靶点。通过抑制ATM介导的DDR通路或TOP1，可以破坏ecDNA的维持，从而抑制癌细胞的生长和生存。这项发表在Cell杂志上的研究，如同点亮了一盏明灯，揭示了ecDNA在癌细胞中复制和维持的关键分子机制。研究证实了ecDNA的复制会引发DSBs，并激活ATM介导的DNA损伤反应。拓扑异构酶TOP1和TOP2B是产生这些DSBs的关键因素。细胞通过alt-NHEJ通路（包括POLQ和LIG3等核心成员）来修复ecDNA上的DSBs，而这一修复通路对于ecDNA维持其环状结构至关重要。ecDNA维持与DDR通路之间的这种reciprocal interaction，为我们提供了全新的视角。ecDNA+肿瘤细胞高度依赖这种机制来维持其致癌基因的扩增和高表达，这恰恰成为了它们的致命弱点。通过靶向ATM介导的DDR通路，我们可以“釜底抽薪”，破坏ecDNA的维持，从而抑制肿瘤的生长。当然，这项研究也存在一些局限性，例如未能直接纯化ecDNA相关的蛋白质，对拓扑异构酶如何导致DSBs的机制还需要更深入的探索，以及对有丝分裂期以外的DSB修复机制研究尚不充分。但这些局限也指明了未来的研究方向。总而言之，这项工作不仅极大地拓展了我们对ecDNA生物学功能的理解，更指出了ATM介导的DDR通路和alt-NHEJ作为潜在的治疗靶点，为开发治疗ecDNA+肿瘤的新策略带来了希望。未来，针对这些通路进行更深入的研究，有望为癌症患者带来更精准、更有效的治疗方案。让我们拭目以待！参考文献Kang X, Li X, Zhou J, Zhang Y, Qiu L, Tian C, Deng Z, Liang X, Zhang Z, Du S, Hu S, Wang N, Yue Z, Xu Y, Gao Y, Dai J, Wang Z, Yu C, Chen J, Wu Y, Chen L, Yao Y, Yao S, Yang X, Yan L, Wen Q, Depies OM, Chan K, Liang X, Li G, Zi Z, Liu X, Gan H. Extrachromosomal DNA replication and maintenance couple with DNA damage pathway in tumors. Cell. 2025 Apr 24:S0092-8674(25)00414-3. doi: 10.1016/j.cell.2025.04.012. Epub ahead of print. PMID: 40300601.声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！往期热文：Nature Methods | 告别“平面时代”！光学显微镜如何带你看清3D细胞世界的秘密？Nature | 帕金森病新曙光！iPS细胞人体试验结果揭晓，安全有效性初显！Cell | 实时见证“基因之吻”：Oligo-LiveFISH高精度追踪增强子-启动子动态互作Nature Biotechnology | 重磅综述：不止CAR-T！唤醒免疫“特种部队”，工程化先天细胞开启抗癌新纪元Cell | 整合体（Integrator）“失职”如何引爆细胞“双链RNA炸弹”并触发应激风暴？Cell | T细胞的“模糊逻辑”：研究人员借TCR信号为CAR-T细胞打造精准制动系统