摘要:在英国（UK）2022/23年度，流感病毒感染率回升至COVID-19大流行前的水平，给本已紧张的国家卫生服务（NHS）带来了沉重负担，这主要是由于初级保健和急诊就诊次数的增加以及随后的住院治疗。年龄在4岁以下和65岁及以上的人口群体，以及那些有潜在健康问题的人，面临流感相关住院的最大风险。流感病毒疫苗技术的最新进展可能有助于减轻这一负担。本综述旨在通过描述目前在英国和更广泛地区使用的不同技术，总结流感病毒疫苗领域的进展。综述还描述了正在开发中的疫苗技术，包括mRNA和通用流感病毒疫苗，这些疫苗旨在提供更广泛或增强的保护。这是一个激动人心且重要的流感病毒疫苗时代，进步对于保护一种仍然给所有人群带来沉重负担的疾病至关重要，尽管自首批流感病毒疫苗部署以来已经过去了80多年，这种病仍然对最脆弱的人群产生不成比例的影响。 1.引言虽然流感病毒已经流行了数个世纪，疫苗已有80多年的历史，但在过去二十年中，流感研究和控制取得了实质性进展，包括引入了几种新的疫苗技术。在这篇综述中，我们首先简要概述了当前的流行病学和疫苗政策格局，然后描述了现有的疫苗技术以及有关其效力和效果的临床数据。 1.1.流感负担流感病毒在英国（UK）和全球范围内造成了巨大的疾病负担。2017年，全球估计有14.5万人死亡，950万人因流感相关的下呼吸道感染而住院。在COVID-19大流行期间流感病例数减少后，最近的数据显示，病例数现在与大流行前的水平相当（图1）。图1展示了2016/2017至2022/2023流感季节期间，全球流感监测和应对系统（GISRS）为世界卫生组织欧洲区域分析的流感病毒样本。数据来源于FluNet（https://www-who-int.libproxy1.nus.edu.sg/tools/flunet）。根据许可证（https://creativecommons.org/compatiblelicenses），已对该图的风格和格式进行了修改。GISRS代表全球流感监测和应对系统，WHO代表世界卫生组织。在2022/23年度英格兰流感季节，有8751例确诊的流感病毒感染住院病例，估计有14623例与流感相关的超额死亡。与2018/19和2019/20季节的5144和8800例超额死亡相比。4岁及以下儿童和65岁及以上成人有最高的流感相关住院风险。其他有严重流感疾病或并发症风险的人口亚群包括那些有慢性医疗或免疫抑制状况的人，如移植接受者，以及有高风险增加暴露于流感病毒的卫生保健工作者。在英国，认为有风险的医疗状况和推荐接种流感病毒疫苗的群体列在表1中；这些群体在不同国家之间会有所不同。此外，流感病毒感染增加了孕妇的住院风险，并且可能对发育中的胎儿造成伤害。因此，建议孕妇在任何孕期接种灭活流感病毒（IIV）疫苗，为母亲提供保护，并通过被动方式为婴儿在最初的2-3个月提供保护。支持这一建议的证据包括一项测试阴性的病例对照研究结果，该研究表明母亲接种流感病毒疫苗与3个月以下婴儿的疫苗效力为53%相关[95%置信区间（CI）：30, 68]，针对流感相关住院和急诊科就诊。与流感病毒感染相关的急性呼吸道症状已被广泛报道；然而，更近期的研究表明，流感病毒感染与广泛的不良结果和长期影响有关，包括加重潜在医疗状况，增加对继发细菌感染的易感性，心血管事件如心肌梗死，具有高基线脆弱性的老年人功能下降，以及妊娠并发症。因此，通过季节性流感病毒疫苗接种降低疾病严重程度可能会导致一系列健康益处。 1.2.流感病毒特点流感病毒有四种类型；其中，流感A型和B型病毒会引起季节性流行。流感A型病毒被分为不同的亚型，而流感B型病毒则被分为两个不同的谱系，即B-Victoria和B-Yamagata。流感A型病毒根据病毒表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）糖蛋白的类型存在不同的亚型；这些糖蛋白有助于感染宿主细胞。HA允许病毒进入宿主细胞，而NA则从宿主细胞中切割成熟的病毒。有证据表明，针对HA和NA的抗体通过不同的机制发挥作用，而HA抗体能够阻止流感病毒感染，NA抗体则允许感染但可能会减轻疾病严重程度。在病毒复制过程中，HA和NA表面糖蛋白自然发生突变，有时会导致不同的抗原特性。抗原漂移涉及HA和NA的小变化，这些变化通常随时间积累，可能导致病毒在抗原上与以往流感毒株感染或疫苗接种后产生的抗体不再那么识别，随着时间的推移，这会导致以前获得的免疫力降低。抗原漂移发生在流感A型和B型病毒中，可能导致流行病。流感A型病毒也可能由于基因重组发生抗原转变，包括编码HA和/或NA的基因发生重大且突然的变化。例如，2009年出现了一种新的流感A型（H1N1）病毒（S-OIV），该病毒的基因来自北美和欧亚大陆的猪、人类和鸟类，引发了大流行。如果转变足够大并涉及人类中新颖的亚型，它们可能导致新的流感A型病毒亚型，人群对此几乎没有或没有免疫力，从而引发大流行。从理论上讲，未来的大流行性流感病毒也可能通过新型非人类亚型逐渐适应人类而出现。 1.3.流感病毒疫苗开发历史疫苗接种仍然是预防流感病毒感染及其相关并发症最有效的公共卫生干预措施。流感A型病毒（H1N1株）最早于1933年被分离出来，1935年该病毒随后在受精鸡蛋中培养。1938年开发出第一种流感病毒疫苗（图2），是一种含有单一流感A型毒株的灭活制剂，称为单价疫苗。流感B型病毒随后于1940年被发现，1942年开发出含有流感A型和B型两种病毒的灭活二价疫苗。1977年，流感A型H1N1株的再次出现促使世界卫生组织（WHO）在1978年推荐三价疫苗（针对流感A型H1N1和H3N2株以及B型病毒），以确保有效保护。在1980年代，抗原漂移导致两种抗原上不同的流感B型病毒谱系的传播。在2001年至2011年之间的10个赛季中，有5个赛季三价疫苗对流通的流感B型病毒几乎没有或不提供保护。这促使随后开发并于2012年首次批准了四价灭活流感病毒疫苗（QIIV），该疫苗可保护两种流感A型（H1N1和H3N2）和两种流感B型病毒株（B-Victoria和B-Yamagata谱系）。流通的亚型继续变化，自2020年3月以来没有检测到流感B型Yamagata病例，2023年，WHO建议恢复三价疫苗，省略B-Yamagata株。鉴于疫苗仅对流通的病毒株有效，且B-Yamagata不再流通，从QIIV疫苗中移除该株不太可能影响由此产生的三价灭活流感病毒疫苗（TIIV）的有效性。这一时间线突出了流感的动态性质，需要在疫苗接种方法中考虑（图2）。图2 流感病毒疫苗开发历史及英国免疫计划的发展。2020年在英国为健康成人引入了资格，但在2023年在英格兰、威尔士和北爱尔兰被取消（在出版时仍在苏格兰）。图中的上标字母代表如下参考文献。(a) 参见参考文献[52]。(b) 参见参考文献[53]。(c) 参见参考文献[54]。(d) 参见参考文献[55]。(e) 参见参考文献[56]。(f) 参见参考文献[57]。(g) 参见参考文献[58]。(h) 参见参考文献[59]。(i) 参见参考文献[60]。(j) 参见参考文献[61]。(k) 参见参考文献[62]。(l) 参见参考文献[63]。(m) 参见参考文献[64]。(n) 参见参考文献[65]。*临床风险群体中患者包括患有慢性呼吸系统疾病、慢性心脏和血管疾病、慢性肾脏疾病、慢性肝脏疾病、慢性神经系统疾病、糖尿病/肾上腺功能不全、免疫抑制、脾切除/脾功能不全和病态肥胖的患者。护理人员或免疫受损个体的家庭接触者也可能符合条件。BMI，体重指数；EU，欧洲联盟；US，美国。 1.4.WHO关于毒株选择的建议流感病毒的抗原漂移和转变需要定期更新季节性疫苗的组成以保持有效。每年，WHO都会对北半球（10月至2月）和南半球（9月至1月）流感季节的流感病毒疫苗的病毒组成提出建议。这些建议比相应季节提前6个月，并基于WHO全球流感监测和响应系统生成的监测数据。世界各地指定的国家流感中心将分离的病毒送往WHO合作中心进行遗传和抗原特征分析，包括英国的弗朗西斯·克里克WHO合作中心，这些中心的数据用于通知下一季节所需流感病毒疫苗组成的建议。在英国，由英国卫生安全局进行国家监测，该机构汇总和解释提供流感活动信息和全因死亡率估计的数据。在每个流感季节进行的监测还允许估计疫苗的有效性，这可以通知当地的建议。 1.5.国家免疫计划大多数国家流感政策建议对有流感相关并发症风险的特定人群进行疫苗接种。随着疫苗技术的发展，国家免疫技术咨询小组（NITAGs）的建议不断演变，在接种的年龄和人群、疫苗类型和剂量方面各国有所不同。建议的差异源于可用疫苗的特性、临床数据和使用的当地监测数据，以及负担能力和成本效益标准。为确保NITAG政策建议的一致性和透明度，WHO建议使用系统化、标准化的决策过程。应使用如推荐评估、开发和评估（Grading of Recommendations Assessment, Development, and Evaluation, GRADE）等方法评估证据质量，尽管尚不清楚所有国家是否实施这种方法。在英国，由疫苗接种和免疫联合委员会（JCVI）制定针对人群水平的疫苗接种建议，该委员会审查需要流感病毒疫苗接种的临床风险组的标准。自2000年以来，临床风险组的名单已经扩展（图2），儿童的常规年度流感病毒疫苗接种的合格年龄组也已扩展（图2）。 1.6.流行病防备疫苗世界卫生组织制定了一个框架，以加强对大流行性流感的防备，其利用了现有系统对季节性流感的能力。几个各国已签订针对大流行性流感病毒的预购协议疫苗，包括英国、美国和澳大利亚。mRNA平台将是一个由于其能够促进快速如在新冠肺炎大流行期间所证明的新抗原的掺入. 甲型流感病毒亚型H5N1现在在野生水鸟中流行是一种严重的、高度传染性的流感病毒，在易感禽类中传播。这个野生水禽、商业和家禽、猪和人类中流感病毒之间的基因交换增加，对人类构成持续威胁。最近，公共卫生问题因疫情的蔓延而加剧新型高致病性禽H5N1流感病毒HA分支2.3.4.4b进入奶牛体内，在那里，它似乎是通过牛奶传播的。已经出现了以下情况种间传播给人类，而且这种情况还在持续由全球卫生部门监测。尽管目前人们对大流行疫苗，特别是甲型H5N1流感病毒感兴趣，但这是超出了本综述的范围，并在最近的一篇综述文章中进行了评估。 1.7.流感病毒疫苗技术从20世纪40年代到2010年代，IIV技术基本保持不变，由在鸡胚中生长的灭活病毒组成。流感病毒自2000年以来，使用基于鸡蛋的技术生产的疫苗在英国已经上市1960年代。基于鸡蛋的技术仍然是最常用的流感病毒疫苗全球生产方法，主要是由于可用性、制造能力和可扩展性、低成本和历史使用，并收集安全性和耐受性数据50年。然而，过去二十年的技术进步使开发制造流感病毒疫苗的替代技术，旨在克服标准鸡蛋疫苗的某些局限性。目前，英国有六种不同的流感病毒疫苗类型，其中五种是使用与标准剂量蛋基IIV不同的技术制造[佐剂QIIV、基于细胞的QIIV、高剂量QIIV、减毒流感病毒活疫苗（LAIV）和重组QIIV]。尽管这些技术已经之前有不同程度的描述（105113-117），最近没有发表全面详细地总结技术和特点，以及临床数据。以下部分是对流感病毒疫苗领域的进展，描述疫苗技术在英国和更广泛地使用，并审查相关的临床数据。 2.材料和方法 2.1.文献检索我们在PubMed数据库和Cochrane图书馆进行了文献检索，涵盖a从2018年1月1日至2024年7月15日的约6年期间，仅限于英语见习契约最初选择2018年是因为这是增强型流感病毒疫苗（即标准剂量蛋基流感病毒疫苗以外的疫苗）在英国上市，与其他国家的标准剂量鸡蛋疫苗。完整的搜索策略，包括搜索词（表S1）和文章选择的资格标准（表S2）为如补充材料所述。过滤器仅适用于随机分组对照试验（RCTs）、系统评价和荟萃分析。文章包括在内如果他们描述了调查流感疗效或有效性的临床研究具有报告的临床结果的病毒疫苗，例如（但不限于）实验室证实的流感病毒感染（病毒培养记录的阳性流感检测，荧光抗体检测、逆转录聚合酶链式反应或快速流感诊断检测）、流感样疾病（ILI）或流感相关住院治疗。没有标准，ILI的国际定义；本综述中的大多数研究将ILI定义为一种临床基于头痛、高温、咳嗽和肌肉等症状的诊断疼痛。世界卫生组织将ILI定义为过去发病的急性呼吸道感染10天，出现咳嗽，体温≥38°C美国疾病控制与预防中心（CDC）认为发烧≥37.8°C，咳嗽和/或疼痛喉咙。尽管免疫原性数据是每年重新获得许可的主要标准，但它们由于缺乏全球标准化的保护措施，此处未进行描述使用诸如血凝抑制试验和与临床保护相关性相关的不确定性。一些研究已经研究了流感病毒疫苗对更广泛相关疾病的影响患有流感，例如心血管疾病，但这些不包括在内综述的重点是呼吸道感染和疾病。作为安全配置文件流感病毒疫苗已经建立，这些数据不包括在内在结果表中，但在文本中进行了讨论。季节性流感病毒疫苗被纳入审查，并根据以下因素进行分组以下技术： •使用基于鸡蛋的技术生产的IIV（进一步细分为标准剂量、佐剂和高剂量）。 •LAIV。 •重组流感病毒疫苗。 •使用基于细胞的技术生产的IIV。研究选择策略的总结见补充材料（图S1）。PubMed数据库和Cochrane图书馆检索共返回278篇出版物，另有4篇符合在单独的“手动搜索”中确定了纳入标准（图S1）。申请后根据排除标准，选择41篇文章纳入本综述（表2至表7）。数据综合采用了叙述性方法。 2.2.证据摘要对于每种疫苗技术，都会简要介绍其发展历史，然后根据关键特征和可用临床结果数据的总结。在可用的情况下，绝对和/或相对疫苗效力和有效性的数据如下总结。疗效和有效性是与治疗相关的不同概念疫苗的性能。疫苗效力在严格控制下进行测量条件，使用随机对照试验；而疫苗有效性探讨的是在现实世界中接种疫苗，通常使用观察方法。虽然观察性研究具有优势，但存在固有的偏倚风险；为了减轻这种情况，可以实施在现实世界环境中使用随机化的研究。 3.疫苗技术综述 3.1.制造流感病毒疫苗：基于鸡蛋的技术基于鸡蛋的疫苗制造用于通过经典遗传方法生产IIV和LAIV重组。这涉及世界卫生组织候选病毒与选定的IIV的高生长病毒（能够在卵和细胞中以高滴度复制），或将LAIV的主供体减毒病毒植入鸡胚中。然后在抗逆转录病毒抗体存在的情况下通过扩增选择合适的种子病毒高生长病毒或主供体病毒的HA和NA。由此产生的病毒用于疫苗生产（图3）。这种适应鸡蛋的疫苗株病毒然后在进行纯化和配制之前大规模生产。图3 基于鸡蛋、基于细胞、重组和mRNA疫苗技术的概览。DNA，脱氧核糖核酸；HA，血凝素；mRNA，信使核糖核酸。鸡蛋疫苗的生产取决于胚胎疫苗的可用性鸡蛋和流感病毒在鸡蛋中传播的能力，这两者都是时间生物安全密集型（图3）（174175）。特别是制造过程需要一个漫长的计划和执行过程，可能需要几个月的时间（通常至少4-6个月）（175176）。一些流感病毒株（特别是H5N1等禽流感病毒株）对产蛋量产生负面影响；因此使用这种技术可能不适合生产所需的大滴度流行病。此外，基于鸡蛋的生产可能会受到以下因素的“鸡蛋适应”的影响流感病毒，导致HA蛋白抗原结构的变化。这种卵子适应可能会导致抗原之间的抗原差异在疫苗和世界卫生组织推荐的菌株中。抗原现象由卵子适应引起的突变在H3N2病毒中尤为突出；一项研究研究发现，病毒在卵子中传播15次后，有3次发生了突变HA中的氨基酸序列，其中两个位于受体表面附近结合位点。提供世界卫生组织推荐的菌株与循环相匹配这将降低疫苗的有效性，因为人类的免疫反应可能不是世界卫生组织推荐的野生病毒株。JCVI指出，鸡蛋适应问题是一个“真正的问题”，但强调其影响可能仅限于H3N2毒株占主导地位的流感季节。 H3N2病毒的卵子适应可能比H1N1更常见因为前者有更长的时间来适应人类的气道，变得不那么像禽流感病毒。当在鸡蛋中生长时，人类H3N2病毒可能会在HA的受体结合位点发生突变，以促进其生长，这可能会改变HA的抗原性。据估计，这反过来又会导致流感疫苗的绝对有效性提高了16%。尽管有这些潜力基于鸡蛋的技术已经建立并使用了几十年成功支持流感免疫计划的实施。尽管研究表明，对鸡蛋过敏的人可以安全接种鸡蛋疫苗（186187），不建议接种这些疫苗对某些鸡蛋过敏的人。英国以外的医疗保健专业人员应咨询当地有关使用蛋基疫苗的相关指南鸡蛋过敏者。 3.1.1.标准剂量灭活流感病毒疫苗 3.1.1.1.技术概述 IIV有三种类型：全病毒体、裂解病毒体和亚单位疫苗（图3）。最常见的是通过化学修饰实现整个疫苗灭活，使用甲醛或β-丙内酯或通过紫外线物理操作γ射线照射。甲醛充当交联剂；通过该机制，甲醛抑制病毒基因组复制并引发病毒基因组降解，从而降低病毒传染性。β-丙内酯主要作为核酸发挥作用酸烷化剂，抑制病毒基因组复制。紫外线辐射和伽马射线辐射主要导致病毒基因组的破坏，干扰病毒宿主细胞中的复制和转录。在裂解病毒颗粒疫苗中，病毒包膜具有使用表面活性剂破坏。裂解病毒颗粒疫苗可以进一步纯化去除其他病毒成分，如内部亚病毒核心，以产生病毒含有HA和NA抗原的亚基（亚基疫苗）。现行标准除其他病毒成分外，TIIV和QIIV制剂的剂量还含有每种菌株每剂量标准化15µg HA。 3.1.1.2.临床数据：疗效和有效性 IIV在所有年龄段都显示出疗效，包括6个月大的儿童和青少年17岁以下，65岁以上的成年人和孕妇（表2）。由于基于鸡蛋的SD IIV是之前的标准护理新技术的发展，疫苗疗效的历史比较有效性主要是安慰剂（如生理盐水）、非流感病毒疫苗控制或不接种疫苗（表2）。新技术可以与基于鸡蛋的SD IIV。一项系统综述和荟萃分析，包括41项关于儿童和青少年的研究2-16岁的青少年表明，与安慰剂或未接种疫苗相比，IIV治疗与实验室确诊流感风险降低64%有关（95%CI:52,72；N=1628；高确定性证据），ILI降低28%（95%CI：21，35; N=19044；适度确定性证据；表2）。在系统综述和对25项针对16-65岁健康成年人的研究进行荟萃分析，比较IIV与安慰剂组或未接种疫苗的对照组，实验室确诊流感的风险为降低了59%（95%置信区间：53，64；N=71221；中等确定性证据），风险IIV后ILI降低了16%（95%置信区间：5.25；N=11924；低确定性证据）（表2）。Cochrane对≥65岁成年人的综述结果表明IIV在一个季节内将实验室确诊流感的风险降低了58%与安慰剂相比（95%CI:34,73；N=2217；低确定性证据），风险与未接种疫苗的人相比，ILI（主观报告）的感染率提高了41%单一流感季节（95%置信区间：27，53；N=6894；中等确定性证据；表2). 在三项随机对照试验的汇总估计中，QIIV的疫苗疗效与对照组[安慰剂或非流感（脑膜炎球菌ACWY）疫苗]对孕妇实验室确诊流感的抵抗率为50%（95%CI:32,63；表2）。 3.1.1.3.临床数据：安全性接种IIV疫苗有一些常见的不良反应（AEs）。与安慰剂相比，IIV与成人≥18岁发热风险增加有关，并且与成人≥65岁手臂疼痛和肿胀风险增加有关。在一项针对6-35个月大儿童的多国随机对照试验（RCT）中，QIIV、TIIV和安慰剂的安全性概况相似，只是QIIV与安慰剂相比，注射部位反应更为频繁。尽管基于鸡蛋的SD-IIVs在英国的使用逐渐减少，在一些国家，它们仍然被使用，特别是在年轻群体中，并被用于国家免疫计划。实际上，SD-IIVs现在只推荐在英国用于<65岁的“高危”群体作为第三选择，在JCVI推荐的一线或二线选择同时无法用于疫苗接种的情况下。 3.1.2.高剂量灭活流感病毒疫苗 3.1.2.1.技术概览随着年龄的增长，老年人（≥65岁）的体液和细胞免疫能力逐渐下降，这种现象被称为免疫衰老（immunosenescence），它被认为会增加疾病易感性和严重性，并减少对疫苗接种的反应。高剂量IIV疫苗是使用与标准剂量基于鸡蛋的疫苗相同的技术生产的，但除了其他病毒成分外，每种毒株含有更高剂量的血凝素（HA）（每株60微克而不是15微克）。更高剂量的HA可以诱导增加的接种后HA特异性抗体滴度，并提供增强的流感保护，这使得它们特别适合老年人使用。 3.1.2.2.临床数据：有效性和效果与标准剂量的IIV疫苗相比，高剂量IIV疫苗在保护实验室确诊的流感或流感样疾病（ILI）方面显示出改善的疫苗效果（表3）。在一项包含12个连续流感季节数据的21项研究的荟萃分析中，涉及4500万名≥65岁个体，高剂量TIIV显示出与标准剂量TIIV/QIIV相比，对实验室确诊的流感或可能的ILI有改善的保护效果（相对疫苗有效性为24.1%；95% CI：10.0, 36.1）（表3）。对于成人（包括≥65岁成人和免疫受损成人）的实验室确诊流感的效力也有类似的结果；高剂量TIIV与标准剂量SD-TIIV相比，风险降低了24%（95% CI：10, 36）（表3）。在一项包含5项针对≥65岁成人的随机对照试验（RCT）的荟萃分析中，使用高剂量TIIV/QIIV与标准剂量TIIV/QIIV相比，与肺炎或流感相关的住院风险降低相关（汇总相对疫苗效力：23.5%；95% CI：12.3, 33.2；表3）。 3.1.2.3.临床数据：安全性在一项包括36项成人（≥18岁）研究的系统评价中，高剂量IIV疫苗与标准剂量IIV疫苗相比，与更高的局部和全身不良反应（AEs）发生率相关，包括头痛、寒战和不适的频率更高。 3.1.3.佐剂灭活流感病毒疫苗 3.1.3.1.技术概览佐剂灭活流感病毒疫苗（Adjuvanted IIVs）是使用与标准剂量或高剂量基于鸡蛋的疫苗相同的技术生产的，但添加了佐剂。佐剂是能通过各种信号通路增强疫苗诱导的免疫反应的幅度、广度和持久性的物质，导致增强的趋化因子和细胞因子分泌以及免疫细胞的激活。常见的疫苗佐剂包括明矾、油包水乳液（如MF-59和AS03）、明矾、乳液和/或脂质体的组合，以及类似受体配体。与高剂量IIV疫苗一样，佐剂疫苗相比非佐剂疫苗可能具有更好的免疫原性，这使得它们适合于体液和细胞免疫能力逐渐下降的老年人。 3.1.3.2.临床数据：有效性和效果在一项涉及6个月至5岁儿童的多中心随机对照试验（RCT）中，跨越两个流感季节（2013-2015），显示含有MF59佐剂的疫苗（aQIIV）在预防实验室确诊的流感方面与IIV（TIIV或QIIV）相比是有效的，特别是在6-23个月的亚组中[相对疫苗效力31.37%（95% CI：3.14, 51.38）]，但对整体研究人群（6个月至5岁）而言并非如此，相对疫苗效力为-0.67%（95% CI：-19.81, 15.41；表4）。这可能是因为2岁以下的儿童的免疫系统尚未成熟，已知对标准流感疫苗的反应相对较差。一项系统评价和48项研究的荟萃分析的证据表明，与未接种疫苗相比，佐剂标准剂量基于鸡蛋的流感病毒疫苗在预防老年人（≥65岁）的实验室确诊流感方面也是有效的（绝对疫苗效力为45%；95% CI：23, 61；来自三个流感季节的五项非随机干预研究）并且与非佐剂疫苗相比具有类似的相对疫苗效力（表4）。然而，一项对九项真实世界证据研究的11项分析的系统评价报告称，与非佐剂标准剂量疫苗相比，佐剂三价疫苗在减少流感相关结果方面明显更有效（佐剂与非佐剂TIIVs的相对疫苗效力范围从7.5%到25.6%，与非佐剂QIIVs的范围从7.1%到36.3%；表4）。 3.1.3.3.临床数据：安全性佐剂疫苗与非佐剂标准剂量基于鸡蛋的疫苗相比，与更频繁的局部和全身不良反应（AEs）相关，包括手臂疼痛/触痛、发热、肌肉痛和寒战的频率更高。这也在非流感病毒疫苗中观察到，可能与佐剂的作用机制有关。 3.1.4.减毒活流感病毒疫苗 3.1.4.1.技术概览减毒活流感病毒疫苗（LAIVs）使用“冷适应”病毒，这些病毒是通过化学诱变或在逐渐降低温度的鸡蛋中连续传代流感病毒来引入突变。由于流感病毒的分段病毒基因组，有可能混合不同毒株的遗传物质。在LAIV的情况下，来自减毒冷适应株的内部基因片段（PB1、PB2、PA、NP和M NS）随后与目标病毒株的HA和NA结合，创建一个重配疫苗病毒（图3），它在低温下（上呼吸道）有效复制，但在高温下（下呼吸道）不复制。HA和NA基因的特定组合可以影响重组疫苗病毒的免疫原性。疫苗病毒与先天免疫反应之间的相互作用可能塑造下游适应性反应。 LAIV的设计是在上呼吸道的低温下复制，需要通过鼻内给药。这种给药方式便于管理，使它们比注射疫苗更容易被儿童接受，因为它们可能与很少或没有疼痛相关。与其他给药途径相比，LAIV通过涉及系统和粘膜免疫反应提供更广泛的反应。此外，LAIV还可能诱导强烈的流感病毒特异性细胞反应。LAIV疫苗接种诱导的粘膜免疫反应是通过针对HA表面糖蛋白的粘膜免疫球蛋白A（IgA）介导的，HA特异性IgA反应大于IIV诱导的反应。通过LAIV诱导呼吸道粘膜免疫反应可能比单独的系统免疫更具有保护性，通过在进入点阻止病毒感染。使用LAIVs的一个主要理由是在学校儿童中，特别是那些在小学教育中的儿童，它们还可以提供群体免疫，保护周围人群中的成人和老年人。在小学年龄段儿童引入LAIV后观察到这一点，证明了LAIVs在减少传播方面的影响。由于LAIVs在成人中刺激的免疫反应比儿童弱，可能是由于预先存在的免疫阻止了病毒建立，它们目前在英国不建议或批准用于>18岁的人使用。然而，LAIVs在美国批准用于≤49岁的成人。由于使用活病毒进行免疫接种的潜在感染风险，LAIVs不建议用于免疫功能低下的个体。 3.1.4.2.临床数据：有效性和效果 LAIVs已证明在6个月大的儿童中有效（表5）。与安慰剂或未接种疫苗相比，LAIVs显示出基于包括124,606名3-16岁儿童的随机对照试验（RCT）数据，减少ILI 31%（95% CI：20, 40）（表5）。另一项对<18岁儿童接种三价LAIVs的系统评价和荟萃分析显示，与TIIV相比，实验室确诊的流感风险降低了48%（95% CI：18, 68）（表5）。 3.1.4.3.临床数据：安全性两项随机对照试验的结果表明，四价LAIV在儿童中耐受性良好，与安慰剂相似的不良事件（AE）概况，而在3-17岁儿童的3期随机对照试验中，与安慰剂相比，三价LAIV与发热的发生率显著增加相关。在对<18岁儿童的系统评价和荟萃分析中，四价或三价LAIVs的系统不良事件率与安慰剂相比没有显著更高，三价LAIV至少显示了一个局部不良事件的比率显著高于安慰剂。 3.2.基于细胞和重组流感病毒疫苗的替代技术平台基于细胞和重组流感病毒疫苗是传统基于鸡蛋的疫苗的替代制造平台，这些技术的开发是为了解决前一节中描述的与基于鸡蛋的疫苗相关的问题（例如，鸡蛋适应性），这降低了疫苗的有效性（图3）。以下是这些技术的关键特性和支持这些技术的临床数据。 3.2.1.基于细胞的流感病毒疫苗 3.2.1.1.技术概览基于细胞的灭活流感病毒疫苗的制造过程使用哺乳动物细胞，例如，Madin-Darby犬肾细胞，来培养病毒（图3）。使用这种方法，由CDC培养的候选疫苗病毒被用来接种培养的哺乳动物细胞并允许其复制。然后收集含病毒的液体并纯化病毒抗原。与基于鸡蛋的流感技术相比，基于细胞的技术有多个优点。例如，基于细胞的制造使用更灵活的病毒生产在细胞培养生物反应器中，并且具有更可扩展的技术、缩短的制造时间，以及不受潜在鸡蛋短缺影响的过程。此外，基于细胞的技术在很大程度上克服了基于鸡蛋的流感制造中看到的鸡蛋适应问题。然而，与基于鸡蛋的技术相比，基于细胞的HA和NA蛋白中的突变发生的频率较低。这些突变大多数发生在抗原位点或受体结合位点，如果发生，将可能与鸡蛋适应突变有类似的效应。 3.2.1.2.临床数据：有效性和效果使用基于细胞的技术生产的流感病毒疫苗在儿童和青少年（2至<18岁）以及成人（≥18岁；表6）中对实验室基础的流感都显示出有效性。在一项随机对照试验中，与非流感（脑膜炎球菌ACWY）疫苗相比，QIIV在儿童和青少年（2至<18岁）中减少了54.6%的实验室确诊流感发生率（95% CI：45.7, 62.1）。一项系统评价和19项研究的荟萃分析报告，在两项随机对照试验中，三价基于细胞的疫苗对成人（≥18岁）预防实验室确诊流感的总体绝对疫苗效力为70%（95% CI：61, 77）与未接种疫苗相比（表6）。此外，在一项系统评价和对≥4岁个体的真实世界证据研究的荟萃分析中，QIIV预防实验室确诊流感的绝对疫苗效力在五项汇总研究中估计为37.6%（95% CI：19.4, 55.9）与基于鸡蛋的TIIV/QIIV的26.1%（95% CI：6.7, 45.4）相比。 3.2.1.3.临床数据：安全性一项系统评价发现，与基于鸡蛋的传统IIV相比，基于细胞的流感病毒疫苗与出现瘀伤的比率显著更高；其他局部反应（疼痛、发红、肿胀和硬结）的比率在两组疫苗之间相似。 3.2.2.重组流感病毒疫苗 3.2.2.1.技术概览与基于鸡蛋或细胞的流感病毒疫苗不同，重组流感病毒疫苗中的抗原直接从遗传序列中通过重组蛋白技术表达；生产过程中不需要鸡蛋或候选疫苗病毒（图3）。对于重组流感病毒疫苗，使用了一种成熟的病毒疫苗和基因治疗载体的生产平台，即杆状病毒表达载体系统。首先，流感病毒HA基因通过同源重组克隆到杆状病毒基因组中。然后，得到的重组杆状病毒被转染到昆虫细胞中。一旦宿主昆虫细胞被重组杆状病毒转染，它就会指导细胞快速产生HA抗原（图3）。由于HA抗原直接从遗传序列中表达，而不是从鸡蛋或哺乳动物细胞中复制的流感病毒中衍生，因此避免了重组疫苗生产过程中潜在的鸡蛋适应性和细胞适应性突变。因此，表达的HA抗原在遗传上与选定的流感毒株完全相同，例如，由世界卫生组织推荐的的季节性毒株。目前市面上的重组疫苗只包含HA，浓度是标准剂量基于鸡蛋的疫苗的三倍（45微克），这与限制突变一起，可能有助于比标准剂量基于鸡蛋的QIIV更高的疫苗效力，如临床试验所示。使用重组技术生产流感病毒疫苗所需的时间（2-3个月）比基于鸡蛋的疫苗短，并且重组疫苗不需要额外的灭活步骤。此外，与基于鸡蛋的疫苗不同，重组疫苗不含有任何痕迹的鸡蛋蛋白、抗生素或防腐剂，使其适合所有对鸡蛋过敏的人，包括那些经历过严重鸡蛋过敏反应的人。 3.2.2.2.临床数据：有效性和效果系统评价中识别的一项研究发现，重组TIIV在18-55岁的成人中对实验室确诊的流感显示出45%（95% CI：19, 63）的相对疫苗效力，与安慰剂相比（表7）。这项系统评价的另一项随机对照试验发现，重组QIIV在预防实验室确诊的流感方面比标准剂量基于鸡蛋的QIIV在50岁及以上成人中有更高的相对疫苗效力（相对疫苗效力为30%；95% CI：10, 47；一项随机对照试验，中等确定性证据表7）。在41项随机对照试验的系统评价和网络荟萃分析中，与安慰剂相比，重组TIIVs/QIIVs对实验室确诊的流感的疫苗效力为70.6%（95% CI：22.9, 90.2；九项随机对照试验）（表7）。一项集群随机观察研究的结果表明，在50-64岁的成人中，重组QIIV与标准剂量基于鸡蛋的疫苗相比，对实验室确诊的流感的相对疫苗效力为15.3%（95% CI：5.9, 23.8）（表7）。 3.2.2.3.临床数据：安全性系统评价和荟萃分析表明，重组流感病毒疫苗与传统QIIV之间的疲劳、头痛、肌肉痛或恶心的发生率相似，但重组疫苗的寒战发生率显著更高。与IIV相比，重组疫苗的局部反应，包括疼痛、红斑、肿胀和触痛的发生率显著减少。 4.未来疫苗技术 4.1.介绍这篇综述文章的主要焦点是支持英国目前可用的六种流感疫苗类型的临床数据。然而，在这最后一节中，我们简要概述了未来流感病毒疫苗技术。先前描述的“新”流感病毒疫苗技术的开发，以及增加的抗原剂量，与标准剂量基于鸡蛋的技术相比，为流感预防提供了宝贵的改进。并非所有疫苗技术都已经在头对头随机效力试验中针对临床结果（即流感病毒感染或住院治疗）进行了研究，其中对照标准护理标准剂量基于鸡蛋的疫苗。然而，对于那些已经以这种方式进行了研究的疫苗技术，相对于标准剂量基于鸡蛋的疫苗，疫苗效力在预防实验室确诊的流感方面总体上仍然保持中等，估计在成人中高达30%（95% CI：10, 47）（表3至7）。流感病毒疫苗的总体有效性在很大程度上低于其他疫苗可预防传染病的疫苗。例如，预防麻疹感染的疫苗有效性>90%，预防脑膜炎球菌C结合疫苗的脑膜炎病的有效性高达100%。相比之下，针对英国初级保健中所有实验室确诊的流感，18-64岁成人的有效性为49%（95% CI：42, 56），65岁及以上成人的有效性为46%（95% CI：29, 59）。在英格兰，针对流感相关住院治疗的疫苗有效性也可以提高，2-17岁、18-64岁和65岁及以上个体的疫苗有效性分别为54%（95% CI：42, 63）、31%（95% CI：21, 40）和30%（95% CI：22, 37）（在苏格兰，疫苗有效性数据与其他呼吸道疾病归为一组，威尔士和北爱尔兰的数据不可用）。在美国，针对流感病毒疫苗有效性的报告也类似，门诊环境中针对实验室确诊的流感为33%（95% CI：16, 47）至49%（95% CI：47, 51），针对流感相关住院治疗为41%（95% CI：34, 47）至44%（95% CI：32, 54）。因此，仍然存在开发额外技术的需求，这些技术可能克服与当前技术相关的一些缺点，并提高流感病毒疫苗效力。在这里，我们简要概述了目前正在开发或处于许可前临床试验中的各种技术。 4.2.核酸技术、病毒载体和重组病毒样颗粒 4.2.1.技术概览：核酸技术基于核酸（DNA和RNA）的疫苗自1990年代以来一直在开发中，并且提供了相当大的潜力来克服既定疫苗平台的限制。DNA疫苗与先前讨论的重组疫苗不同，它们传递DNA，而不是重组抗原。2021年，基于DNA质粒的SARS-CoV-2疫苗（ZyCoV-D）在印度获得批准，用于12岁及以上个体的主动免疫，以预防COVID-19，这表明该技术可能适用于其他呼吸道感染疾病，如流感。mRNA疫苗中包含的mRNA编码引起免疫反应的病毒蛋白（图3）。mRNA疫苗的生产过程各不相同，但典型的步骤如下：对感兴趣的抗原进行测序，并使用优化的共识序列创建线性化质粒DNA模板，然后进行扩增和纯化。然后使用该DNA模板作为通过RNA聚合酶酶合成目标mRNA的基础。最后，纯化的mRNA被包裹成脂质纳米颗粒以供交付。mRNA疫苗免疫原性和效力的一个关键步骤是纳入修饰核苷酸，这可以减少细胞对mRNA本身的内在反应。与传统技术相比，mRNA疫苗提供了几个好处，包括短暂的制造时间，这将加速疫苗的生产和供应，特别是在大流行期间。此外，更短的制造时间可能意味着mRNA疫苗是在流感季节开始时开发的，以减少时间滞后和季节前或季节期间抗原不匹配的潜力，尽管还需要考虑快速许可和分销的问题。 4.2.2.临床数据目前正在对多种DNA流感病毒疫苗进行1期临床试验。大流行H1 DNA疫苗的1期研究结果显示，它在健康成人（24-70岁）中耐受性良好。作为单一制剂（初次免疫）给予时，H1 DNA疫苗显示出适度的免疫原性。DNA疫苗还可能提供一种潜在的策略来提高当前流感病毒疫苗的免疫原性，如用流感DNA疫苗初次免疫后用灭活疫苗增强的研究中所证明的。在1期临床试验中，H5 DNA初次免疫后给予单价灭活疫苗增强≥12周后，91%的接受者中出现了四倍的血凝抑制（HAI）滴度增加。目前正在研究几种mRNA流感病毒疫苗候选物。针对健康成人≥18岁的季节性流感的四价mRNA疫苗mRNA-1010的1/2期临床试验的最终结果表明，mRNA-1010在25-100微克剂量下对流感A病毒的免疫原性更高，对流感B的免疫原性与标准剂量IIV相似，持续6个月。mRNA-1010的较低剂量通常对流感A病毒株引起更高（12.5和25微克）或相当（6.25微克）的滴度，但对流感B株较低。mRNA-1010引起的预期不良反应比许可的季节性QIIV更常见，通常为1级或2级严重性。正在进行评估mRNA-1010的安全性和效力的3期试验。进行了两项针对可能引起大流行的禽流感H10N8和H7N9病毒的首个mRNA疫苗的1期、随机、安慰剂对照、双盲临床试验，以评估其安全性和免疫原性。疫苗在健康成人中耐受性良好，并引起强烈的体液免疫反应。未来的研究将需要评估不同价数的疫苗的大剂量RNA疫苗的耐受性，以确定是否可以提供多种抗原。 4.2.3.技术概览：病毒载体病毒载体疫苗包含经过修改的基因组，这些基因编码来自特定病原体的目标抗原。病毒载体的优点包括能够引发抗体和细胞反应——后者对于清除病原体感染的细胞很重要——并诱导持久的免疫反应。病毒载体疫苗提供了与mRNA疫苗相似的优势，包括能够快速替换HA盒带。然而，抗载体免疫的潜力带来了挑战，尤其是在重复免疫时。 4.2.4.临床数据评估编码H1N1流感HA基因的腺病毒载体的安全性和免疫原性的1期研究结果显示，在增强疫苗接种后，83%的参与者的HAI滴度增加了四倍。已经为其他传染病进行了1-3期的临床研究，包括针对黑猩猩腺病毒ChAdOX1作为冠状病毒S基因的传递载体的3期试验，对病毒学上确认的COVID-19达到了70%（96% CI：55, 81）的效力。进一步的人类病毒载体流感疫苗的临床试验应能提供这种方法是否会比传统疫苗更有效的见解。 4.2.5.技术概览：重组病毒样颗粒另一种目前正在开发中的流感病毒疫苗新技术是重组病毒样颗粒（VLPs），这些颗粒是在哺乳动物、昆虫和植物表达系统中准备的。重组VLP的生物学和形态特征与野生型流感病毒相似，因此避免了与抗原漂移相关的缺陷。VLPs由病毒衣壳组成，没有复制所需的核心病毒RNA。因此，尽管VLPs包含免疫表位并且具有很强的免疫原性，但它们不具有传染性。 4.2.6.临床数据 Multimeric-001是一种疫苗，由来自流感A型和B型蛋白的保守线性表位组成，这些表位在病毒感染中发挥关键作用。在健康成人中进行的2期、随机、双盲安慰剂对照试验的结果显示，Multimeric-001诱导的多功能CD4+ T细胞反应持续了6个月的随访。在两项3期随机对照试验中，一种植物衍生的VLP流感病毒疫苗在成人中对ILI的保护显著高于安慰剂。在18-64岁成人的研究中，VLP疫苗与安慰剂相比，预防实验室确诊的流感和呼吸道疾病的首要终点70%的绝对疫苗效力没有达到[35.1%（95% CI：17.9, 48.7）]。在65岁及以上成人的研究中，其主要的非劣效性终点是预防ILI；VLP疫苗与灭活疫苗对照相比的相对疫苗效力为8.8%（95% CI：-16.7, 28.7）。 4.3.双价和三价病原体免疫策略组合疫苗减少了预防多种疾病所需的注射次数，并可能增加对免疫计划的遵守。例如，已经长时间提供了组合疫苗DTaP（白喉、破伤风类毒素和无细胞百日咳）和MMR（麻疹、腮腺炎和风疹）。最近，在进行了两项1/2期随机对照试验，调查mRNA疫苗中流感和COVID-19疫苗成分的组合后，一项3期试验成功地证明了与仅针对一种病毒的疫苗相比，成年人≥50岁人群中对两种病毒都产生免疫反应的效力更高。未来的开发还可能包括在单一配方中提供对流感、COVID-19和呼吸道合胞病毒（RSV）的保护的组合疫苗。关于组合冬季疫苗中SARS-CoV-2和流感病毒株的决定应协调以优化生产。 4.4.通用流感病毒疫苗的潜力抗原重组导致疫苗效力降低的风险需要定期监测循环流感病毒并每年重新配制疫苗。预测未来流感季节的循环流感病毒株是困难的，有时会出现抗原不匹配。此外，总是存在大流行性流感病毒出现的风险，无论是由于新的、致病性的重组体还是高致病性禽流感病毒（如H5N1、H7N9和H9N2）传播给人类的动物源性事件（以及促进人与人之间传播的额外遗传变化）。在这些事件发生后，当前的疫苗可能会在随后的大流行中提供很少或没有保护。因此，需要开发“下一代”通用流感病毒疫苗，以保护免受各种流感亚型的影响，包括漂移或异源季节性流感病毒株和可能导致大流行的新出现的株。几种通用流感病毒疫苗候选物正在进行临床开发。一种方法是引入与流感病毒HA茎域高度保守和稳定的表位相关的新抗原目标，而不是高度可变的HA头部。除了扩大保护范围外，针对保守表位的疫苗接种还可能增加保护的持续时间。其他通用疫苗技术包括嵌合HA疫苗，这些疫苗在1期随机对照试验中显示出提供广泛保护流感病毒的潜力。最近提出了一种不针对特定病原体的疫苗设计概念，称为“集成器官免疫”。这涉及先天和适应性免疫系统以及非造血细胞在组织中相互作用，以引发持久的、不依赖抗原的免疫。 5.结束语据估计，在2022/23年英国流感季节，仅英格兰就报告了15,000例超额死亡，主要在65岁及以上成人中，有效的流感预防可能会影响疾病负担和相关的医疗成本。季节性流感病毒疫苗在预防疾病和减轻病情严重程度方面是有效的，并且流感病毒疫苗已经广泛使用了60多年，用于高风险人群亚组的免疫。大多数疫苗是使用基于鸡蛋的灭活流感技术生产的，但在过去十年中，疫苗技术的进步已经看到了不同技术的许可，因此在某些患者亚组中提高了免疫原性和效力。这是数十年研究和开发的结果，仍在进行中，测试新的和现有的配方和平台，以开发最有效的流感病毒疫苗。这对于由于潜在状况而处于风险中的某些人群尤其重要，特别是那些由于免疫衰老而由季节性流感病毒疫苗诱导的保护反应减弱的人群中。在英国，非佐剂基于鸡蛋的疫苗现在已被降级为备用，仅在主要推荐产品短缺时使用。每种流感病毒疫苗技术都有其自身的优点和限制，涉及制造时间和成本、流感病毒株的选择和与季节性循环株的匹配、细胞和鸡蛋适应导致培养病毒的突变，以及免疫原性和反应原性概况。我们总结了与每种流感病毒疫苗技术相关的关键方面，并审查了相关的临床数据。尽管技术进步，但仍存在对有效对抗多种循环株的流感病毒疫苗的未满足需求；这样的疫苗将最大化人群保护。我们的综述有一些限制。文献搜索的纳入标准专门针对随机对照试验、系统评价和荟萃分析，因此审查和总结的数据偏向这些形式的证据。因此，真实世界的研究没有包括在文献搜索中。然而，我们的搜索中的几项系统评价和荟萃分析包括了真实世界的研究。此外，可能有在我们文献搜索之后发表的研究，因此已从本综述中省略。然而，据我们所知，这是第一次全面审查新的流感病毒疫苗技术，针对与流感病毒感染和住院治疗相关的临床效力和效果数据。因此，该综述应为那些对了解流感病毒疫苗进展感兴趣的人提供有用的资源。引入新的流感病毒疫苗技术强调了需要健全和一致的方法来评估流感病毒疫苗接种和免疫计划的性能，特别是与疫苗效力有关，这可能对公共卫生和医疗系统产生重大影响。国家指南在评估流感病毒疫苗效力时，应遵循基于证据的标准，考虑到研究设计的稳健性。在标准化免疫学测定和确定新的免疫标记作为临床保护的相关因素方面的最新进展需要转化为疫苗开发，以便大流行疫苗不依赖于株匹配，这个过程可能需要大约6个月，并可能导致在疫苗可用之前出现大量的发病和死亡。最近在英国推荐的流感病毒疫苗技术的步骤变化是由流感在患者和人群层面上的公共卫生负担所驱动的。持续评估比较（产品特定）和计划性疫苗效力，使用健全的方法，将有助于推荐最有效的疫苗。对研究和开发以及新旧疫苗技术的临床效力的持续投资将进一步增强现有的英国疫苗接种计划。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

疫苗信使RNA

2024-09-10

·生物制品圈

流感疫苗开发与应用进展

摘要：流感病毒是最重要的人畜共患病原体之一，能够引起严重症状，有潜力造成大量死亡和巨大的经济损失。疫苗接种仍然是预防流感病毒感染的最佳选择。已经开发了不同类型的流感疫苗，包括减毒活病毒疫苗、灭活全病毒疫苗、病毒体疫苗、裂解病毒疫苗和亚单位疫苗。然而，它们存在一些限制，如相对较高的制造成本和长时间的生产周期，某些疫苗在特定人群中的中等效力，以及缺乏交叉反应性。这些问题是需要解决的。在这里，我们总结了不同类型流感疫苗开发和应用的最新进展，包括病毒载体流感疫苗的最新发展。我们还描述了基于重组流感病毒作为病毒载体的其他疫苗的构建。本综述文章提供的信息可能会促进安全高效新型流感疫苗的开发。 1.引言流感病毒是一种包膜RNA病毒，其病毒基因组由8个节段的负义单链RNA组成，编码10种核心蛋白，包括聚合酶基础2（PB2）、聚合酶基础1（PB1）、聚合酶酸性（PA）、血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M1和M2）以及非结构蛋白（NS1和NS2），以及其他一些功能性辅助蛋白，如聚合酶基础1-F2（PB1-F2）、聚合酶基础1 N40（PB1N40）、聚合酶酸性-X（PA-X）等。由PB1、PB2和PA组成的聚合酶三聚体复合体与病毒RNA和NP蛋白形成RNA核蛋白（RNP），负责病毒RNA的转录和复制。HA、NA和M2蛋白嵌入病毒颗粒的外层包膜中，其中HA和NA易于暴露，因此是两种主要的免疫原性蛋白。在感染过程中，HA在病毒进入步骤中发挥重要作用，如附着和穿透。HA也是流感病毒表面的主要抗原糖蛋白，可以刺激宿主产生中和抗体反应。NA负责切割细胞表面存在的末端唾液酸残基，从而促进子代病毒从感染细胞中释放，并在流感病毒的传播中发挥重要作用。根据HA和NA的抗原多样性，流感病毒被分类为18个HA亚型（H1-H18）和11个NA亚型（N1-N11）。根据世界卫生组织的估计，全球约有300万至500万人感染流感，导致大约29万至65万例因严重呼吸系统疾病相关并发症而死亡。然而，流感病毒感染通常会导致一种常见的季节性疾病，其特征是较轻的临床表现，如发热、喉咙痛、肌肉无力和一系列相对轻微的呼吸道症状（包括咳嗽和流鼻涕）。大多数患者在一周内从这些症状中恢复；然而，在某些人群亚组中，如老年人、儿童、孕妇和免疫抑制疾病患者，流感病毒感染可能非常严重，可能导致死亡。在20世纪，已经记录了4次流感病毒感染的大流行，包括1918年H1N1大流行（也称为西班牙流感）、1957-1958年H2N2大流行（亚洲流感）、1968-1969年H3N2大流行（香港流感）和2009年的另一次H1N1大流行（墨西哥或猪流感）。据估计，1918年西班牙流感在全球造成了约20亿感染和2100万死亡。在1957-1958年，H2N2亚型流感病毒的爆发起源于亚洲，然后传播到全球，造成约100万至400万人死亡。十年后，由H3N2亚型流感病毒引起的另一次流感大流行起源于香港，导致全球100万至300万人死亡。最新的2009年墨西哥或猪流感大流行是由H1N1亚型流感病毒引起的，影响了214个国家，造成约20万人死亡。除了主要包括H1N1和H3N2的人类流感病毒外，一些流感病毒还可以感染其他动物物种，包括猪流感H1N1、H3N2和H1N2，以及H5、H7和H9亚型的禽流感病毒。值得注意的是，在上述流感大流行中，有几次是由禽源性流感病毒的跨物种传播引起的，如西班牙流感H1N1、亚洲流感H2N2和香港流感H3N2病毒。目前，有几种治疗流感病毒感染的治疗方法。三类抗流感病毒药物可以分类为病毒M2离子通道阻断剂和神经氨酸酶抑制剂（NAIs）。首批获准用于治疗流感病毒感染的抗病毒药物是金刚烷胺和金刚乙胺，这两种小分子药物来自金刚烷药物类别。这两种药物通过作为病毒M2离子通道的抑制剂，通过施加静电阻碍，阻止H+流通过M2通道进入病毒颗粒，从而抑制病毒复制。由于M2离子通道被阻断，病毒核糖核蛋白的传递被阻止。尽管金刚烷胺和金刚乙胺是最早的两种获准抗流感药物，流感病毒迅速进化为具有药物耐药表型的病毒变体，通过在M2的跨膜域的氨基酸位置27、30、31和34处获得突变。在药物治疗后2-3天，30%-50%的患者中可以观察到病毒耐药株。自从金刚烷耐药病毒出现以来，针对流感病毒神经氨酸酶的抑制剂已经被开发出来。扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦是N-乙酰神经氨酸（2,3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸）的衍生物，是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NAIs。这些NAIs结合到NA的活性位点，竞争性地抑制NA与其底物N-乙酰神经氨酸的结合。由于这种抑制，NA不能再从宿主蛋白中切割N-乙酰神经氨酸，从而阻止病毒从细胞表面膜释放。正如预期的那样，在接受这些NAIs治疗的患者中，流感病毒的NA中发生了自然突变。已经描述了两种对NA抑制剂的耐药机制。第一种涉及NA酶催化位点内的突变，破坏了它与药物的直接相互作用。第二种涉及HA的突变，减少了对其受体的亲和力，从而补偿了药物对NA活性的影响。最常见的观察到的突变，如流感A病毒N1 NA亚型的H275Y和N295S（N1编号）；流感A病毒N2 NA亚型的R292K和E119V（N2编号）和流感B病毒的R152和D198N，是赋予NA抑制剂耐药性的NA突变，以减少唾液酸酶活性和/或稳定性。除了上述两种主要的抗流感治疗药物外，还发现了一些新的抗病毒抑制剂，如聚合酶抑制剂（例如法匹拉韦和利巴韦林）、HA抑制剂（例如RO5464466、阿比多尔、MBX2329和MBX2546）、NP抑制剂（例如萘普生和姜黄素）和宿主靶向剂（例如DAS18），它们也可以作为对抗流感病毒感染的额外治疗选择。尽管有几种治疗药物可用于抗流感治疗，但接种流感病毒疫苗仍然是预防和控制流感病毒传播的最有效方法之一，可以显著降低流感病毒感染的发病率和相关医疗并发症。常用的流感疫苗包括灭活流感疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位流感疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组病毒载体流感疫苗。在这篇综述中，我们讨论了不同流感疫苗的优缺点，病毒载体流感疫苗的开发，以及其他使用流感病毒作为载体的病毒疫苗的构建，以提供开发有效和安全新型流感疫苗的重要见解。 2.不同类型的流感疫苗及其优缺点流感疫苗是预防和控制流感病毒感染的重要措施。目前，商业化和实验性的流感疫苗主要包括灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗、病毒体流感疫苗、减毒活疫苗和重组活病毒载体疫苗。 2.1.减毒活流感疫苗（LAIV）减毒活流感疫苗是通过流感病毒基因组中自然发生的突变产生的毒力较低的流感病毒株，或者是通过在病毒易感细胞、胚胎鸡蛋中多次传代所谓的亲本流感病毒，或其他使病毒毒力降低的过程，即不太可能在实验感染动物中引起重大疾病的病毒。选择毒力较低的流感病毒株作为候选疫苗，进一步在人类志愿者中进行测试，然后才能被FDA考虑批准作为人类流感疫苗使用。这种类型的流感疫苗株具有低毒力和致病性，但仍允许病毒在接种后相对较短的时间内感染和增殖。LAIV主要包括流感A(H1N1)、A(H3N2)亚型和流感B病毒的维多利亚系。根据迄今为止公布的数据，LAIV的鼻内接种可以诱导粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫。特别是，LAIV诱导的细胞免疫反应，如高交叉反应性CD8+ T细胞反应和IFN-g+ T细胞反应，在学龄儿童和婴儿中比成人更好。随着反向遗传技术的进步，即在实验室环境中使用称为质粒的圆形DNA片段来工程化病毒的分子方法，许多研究中使用手动删除或替换病毒的毒力基因，以减弱病毒的毒力或工程化病毒携带一个或多个所需的外源基因。使用这些现代技术，可以产生三价和四价LAIV，分别表达三种或四种流感病毒HA基因。四价LAIV已被证明对美国2-17岁儿童提供有效的保护效果。在中国，首个三价LAIV（长春百克生物科技有限公司，中国）于2020年获得市场批准。然而，考虑到LAIV仍然可以在接种者中复制，因此可能通过称为遗传逆转的过程将其基因组演变为亲本样病毒，这可能允许它在人类群体中传播，LAIV可能对公共卫生构成潜在风险。因此，需要更多的研究来调查这些LAIV的安全性，然后才能广泛使用。 2.2.灭活全病毒疫苗在20世纪40年代，由Thomas Francis Jr., MD和Jonas Salk, MD领导的密歇根大学研究小组开发了第一种基于灭活流感A病毒的流感疫苗，并在1945年获得军用许可。他们的疫苗使用受精鸡蛋的方法至今仍用于生产大多数流感疫苗。这种方法涉及在鸡胚（或真核细胞）中培养病毒以允许病毒增殖，然后通过加热或用化学试剂（主要是甲醛）处理来灭活病毒，以减弱病毒的感染细胞和增殖能力。然后添加佐剂以增强最终疫苗配方的免疫原性。灭活全病毒疫苗配方中包含的灭活流感病毒被剥夺了毒力和传播能力，同时保留了病毒表面蛋白抗原（如HA和NA）提供的完整抗原性。因此，灭活全流感病毒疫苗具有高安全性、保持完整病毒抗原组分、高免疫原性、提供长期免疫保护以及无毒力逆转风险的优点。如前所述，反向遗传方法的进步已经彻底改变了制备灭活全流感病毒疫苗的过程，该疫苗由已知毒力基因被删除或以某种方式操纵以灭活病毒的重组流感病毒组成。除了人类使用，灭活全流感病毒疫苗也是预防家禽行业禽流感病毒（AIV）感染的重要工具。中国预防禽流感的流感疫苗主要是灭活全病毒疫苗。2018年，中华人民共和国农业农村部批准的六种灭活禽流感疫苗产品主要针对AIV的H5和H7亚型。这六种疫苗包括重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗和灭活疫苗（H5N2株rSD57+株rFJ56, H7N9株rGD76）。这些疫苗株使用H5N2亚型流感病毒株（D7）作为病毒基因组骨架（提供六个内部病毒基因）和来自H5N1、N5N6和H7N9突变病毒株的HA和NA基因。这些重组疫苗株是通过使用反向遗传技术产生的，针对在中国家禽养殖场主要传播的几种病毒，包括携带2.3.2.1d和2.3.4.4d亚型HA基因的H5亚型病毒，以及在家禽中产生高免疫效应的H7N9病毒。同样，由哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院新批准的重组疫苗，由灭活的重组禽流感病毒（H5+H7）三价疫苗（H5N1株Re-11+株Re-12和H7N9株H7-Re3）组成，也是通过反向遗传技术产生的。值得注意的是，这些AIV灭活疫苗不仅可以预防家禽中的AIV感染，而且对人类公共卫生也大有裨益。自2013年开始，H7N9亚型AIV造成了数百例人类病例死亡，因此被认为是中国的一个主要公共卫生威胁。然而，在2017年9月将H5/H7二价灭活流感疫苗引入家禽业以控制H7N9流感病毒感染后，家禽中H7N9病毒的流行率大幅降低，并且使用这种疫苗对鸡进行免疫接种在预防人类感染H7N9病毒方面也非常有效，事实上，在H5/H7二价疫苗广泛使用后的两年内，仅有4例人类H7N9病例报告，与2016年10月1日至2017年9月30日记录的人类H7N9病例数量相比减少了99.5%。灭活全流感病毒疫苗可以在体内诱导体液免疫，并产生高滴度的特异性IgG抗体。然而，这种疫苗对不同基因型或亚型的病毒交叉免疫保护效果并不理想。此外，还有其他一些缺点，包括相对较低的抗体产生率、相对较低的细胞免疫应答诱导效果，以及更多免疫剂量可能给接种动物带来过大的压力。还有报道指出，灭活全人类流感病毒疫苗可能会引起儿童高热，因此不推荐12岁以下儿童使用。随着疫苗生产工艺的进步，全人类流感病毒疫苗的生产已逐渐被淘汰。相比之下，裂解病毒疫苗和亚单位疫苗的开发和应用取得了进展，这些疫苗可以提供相当和有益的免疫效果，并具有更高的安全性。图1、五种常用流感疫苗的组成：(A) 减毒活流感疫苗，(B) 全病毒灭活疫苗，(C) 裂解病毒流感疫苗，(D) 亚单位流感疫苗，以及 (E) 病毒体流感疫苗。这五种不同的流感疫苗在活性、抗原成分和结构组织上有所差异，这些差异影响了疫苗的免疫原性和保护效力。该图是用 Biorender.com 创建的。 2.3.裂解病毒流感疫苗裂解病毒流感疫苗是基于灭活全流感病毒疫苗制备的。选择合适的裂解剂和条件破坏病毒包膜并裂开病毒颗粒。裂解剂以及病毒的核酸和大分子量蛋白被丢弃，而活性抗原组分（HA和NA）和部分M和NP蛋白（增强免疫反应）得以保留。这种疫苗配方可以集中并增加一定体积疫苗中活性抗原蛋白的水平，这可以在最大程度上刺激抗体产生效果，同时大大减少由病毒颗粒其他组分可能引起的不必要副作用。因此，裂解流感疫苗比灭活全流感疫苗更安全。目前，中国市场上已经批准的这类疫苗包括三价灭活流感疫苗（IIV3）和四价灭活流感疫苗（IIV4）。裂解流感疫苗是IIV3的主要组成部分，而所有的IIV4都是裂解流感疫苗。先前的研究表明，对于6个月以上儿童接种裂解病毒免疫接种，具有令人满意的保护效果，2011-2012年接种数据显示，36-59个月和6-35个月儿童接种IIV3的保护效果分别为58.2%和49.6%。此外，其他研究也表明，IIV4对流感B病毒的免疫原性高于IIV3。IIV4主要包括流感A(H3N2)、A(H1N1)亚型，以及流感B病毒的维多利亚和山形株。血凝抑制（HI）阳性转化率作为衡量接种个体血清中能中和流感病毒的抗体存在的标志，HI的几何平均滴度（GMT）平均增长率，以及疫苗免疫后血清抗体保护率均达到预期，表明疫苗具有高免疫原性。 2.4.亚单位流感疫苗传统的亚单位疫苗是基于裂解病毒疫苗制备的，其中HA和NA抗原蛋白进一步提取、纯化和浓缩。然后，添加相应的佐剂以制备最终的亚单位疫苗配方。或者，随着基因工程技术的进步，分子克隆技术已被应用于构建亚单位流感疫苗。简言之，通过限制性内切酶消化和连接过程，将流感病毒的主要抗原蛋白基因（如HA和NA）克隆到蛋白表达质粒中。将工程质粒转移到原核或真核细胞中，以产生HA或NA蛋白抗原，然后进行浓缩和纯化，添加相应的佐剂以获得最终的亚单位疫苗（严格意思上的亚单位疫苗）。常用的IIV3疫苗包括一些通过这种方法制备的疫苗。例如，Influvac®（Solvay Pharmaceuticals BV, Weesp, The Netherlands）和Agrippal®（Chiron SRL, 现为Novartis Vaccines, Viaflorentina, Italy）疫苗在健康儿童、成人和老年人中显示出良好的免疫原性、安全性和耐受性。由于孕妇极易感染流感病毒，特别为孕妇设计了三价流感亚单位疫苗Agrippal S1和Grippol Plus，这些疫苗符合药品委员会（CPMP）标准，并已显示出为孕妇提供高滴度抗体以及长达6个月的婴儿免疫保护效果。除了人类使用，也广泛研究了猪和家禽的亚单位流感疫苗。Hernandez等同事使用杆状病毒载体系统表达猪流感病毒（SIV）HA蛋白与猪IgG2a Fc结合，可以为猪提供有效的抗H1N1 SIV效果和高滴度血清抗体，并减少肺损伤。此外，Song等同事评估了重组HA1-2亚单位疫苗对禽源H7N9流感的免疫原性，并发现含佐剂的灭活疫苗候选物可以在小鼠中诱导有效的HA1-2特异性体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。值得注意的是，它们有一些缺点，包括相对较低的免疫原性、所需的疫苗剂量大和高生产成本，所有这些都需要进一步改进。 2.5.病毒体流感疫苗病毒体是重组流感病毒包膜，由HA、NA和病毒磷脂组成。它们的颗粒结构使病毒体保持病毒膜融合和细胞结合能力，这可以增加与亚单位和裂解病毒疫苗相比的免疫原性。病毒体可以将封装的货物送入抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并随后诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答。然而，由于缺乏佐剂，病毒体在激活APCs和触发交叉呈递方面的效率不高，这限制了CTL免疫的诱导。因此，添加合适的佐剂可以克服这一缺点。Dong等同事开发了一种新型流感疫苗配方，该配方由含有Toll样受体4（TLR4）配体单磷酸脂质A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni的病毒体组成。体外研究表明，含MPLA的病毒体比未加佐剂的病毒体更能强烈激活APCs，并且用含MPLA的病毒体免疫小鼠，病毒NP附着可以促进NP特异性CTLs的启动。病毒体也被用作短肽抗原的传递系统。Soema等同事构建了含有保守的人类HLA-A2.1流感T细胞表位M158-66的病毒体。在HLA-A2转基因小鼠中评估了这些肽装载病毒体的免疫原性和保护效果。在小鼠和树突状细胞培养中研究了病毒体的传递特性。用含肽病毒体和佐剂CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1转基因C57BL/6小鼠，增加了肽特异性CTLs的数量。用含佐剂的肽装载病毒体免疫接种减少了小鼠在异源流感病毒挑战后的体重损失。自20世纪70年代首次提出病毒体流感疫苗以来，经过20多年的发展，流感病毒体疫苗已积累了足够的临床实验数据，并由此产生了两种产品Epaxal®和Inflexal®，它们分别由瑞士伯尔尼瑞士血清和疫苗研究所在1994年和1997年生产。其中，Inflexal®是一种适用于所有年龄组的佐剂流感疫苗，它在健康和免疫功能低下的老年人、成人和儿童中均显示出良好的免疫原性。它能够诱导B细胞反应并产生病毒抗原特异性抗体。然而，一项临床研究未能证明其能够诱导针对嵌入病毒体的两个肽段（CTL靶标抗原）的CD8+ T细胞。这一缺陷表明的是病毒体技术的局限性，还是仅仅反映了目标抗原选择的非最优性，目前尚不清楚。与灭活全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、亚单位疫苗和病毒体疫苗类似，主要诱导B细胞介导的体液免疫。未来的研究需要开发能够同时诱导细胞免疫和体液免疫的流感疫苗，如前述的减毒活流感疫苗和下文描述的活病毒载体疫苗。活病毒载体流感疫苗利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到不同类型的病毒基因组中，使得这种重组病毒能够在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。 3.病毒载体流感疫苗病毒载体流感疫苗是指利用基因工程技术将流感病毒的抗原蛋白（s）整合到另一种病毒的基因组中，这使得这种重组病毒能在接种宿主体内持续增殖，以确保流感病毒抗原蛋白（s）的高水平表达。这随后在接种个体中诱导特定的抗流感免疫效应和/或非特异性先天免疫效应。常用的病毒（或病毒载体）以将流感蛋白抗原引入接种宿主包括但不限于腺病毒载体、沙粒病毒载体、新城疫病毒载体、杆状病毒载体和疱疹病毒载体。与前述的减毒活流感疫苗（LAIV）类似，活病毒载体疫苗的优点包括其能够诱导针对免疫原蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，以及其能够利用宿主细胞机制表达所需的抗原蛋白。因此，这些特性可以同时诱导体液和细胞免疫应答，在相对短的时间内产生抗体，维持长时间的免疫保护，从而可以发挥高效的免疫效应。此外，活病毒载体疫苗还可用于进一步构建多价疫苗或多组分疫苗，从而减少疫苗产品开发的时间，简化接种过程，并提高不同基因型病毒株之间的交叉保护效果。由于上述优点，活病毒载体流感疫苗具有良好的发展前景，逐渐成为许多新型疫苗生产研究的热点，包括流感疫苗。我们将在下文描述疫苗开发中使用的不同类型的病毒载体及其优缺点。图2、复制缺陷型腺病毒载体流感疫苗的工作原理。携带流感病毒HA基因的复制缺陷型腺病毒载体能够诱导产生高滴度的血凝抑制(HI)抗体。该图是用 Biorender.com 创建的。 3.1.腺病毒载体流感疫苗腺病毒载体疫苗使用腺病毒作为载体，通过将其与腺病毒基因组结合，表达感兴趣的病原体的保护性抗原蛋白的转基因。腺病毒载体疫苗具有几个优点，包括高水平的抗原蛋白转基因表达，以及同时诱导体液和细胞免疫应答的能力。它们也是安全的，易于制备，不需要佐剂。目前，它们被广泛开发作为预防性疫苗。腺病毒载体疫苗策略已被用于尝试开发通用流感疫苗。由于流感病毒包括许多基因型（或亚型），并且可以通过自然遗传突变和/或基因组重排（称为抗原漂移和抗原移位）相对快速地进化，因此同时为个体提供针对不同流感病毒的保护的疫苗生产面临真正的挑战。开发通用流感疫苗是解决这一重要问题的重要方法。为此，已构建腺病毒载体流感疫苗以表达流感病毒蛋白的保守抗原区域，如HA2的茎区、嵌合HA、M2e、NP及其T/B细胞表位，因为这些主要蛋白抗原对各种亚型的流感病毒显示出高度的免疫原性和免疫保护效果。例如，Tutykhina等同事构建了一种携带流感病毒保守M2和NP抗原表位的重组腺病毒载体（Ad5-tet-M2NP），该载体能够诱导高水平的CD8+和CD4+ T细胞产生，表明接种这种重组病毒载体疫苗可以诱导针对流感病毒的强效T细胞介导的免疫应答。接种这种活腺病毒载体疫苗的小鼠在8个月后能够产生高水平的效应记忆CD44+CD62- T细胞，并对五种流感病毒（H9N2、H1N1、H5N2、H2N3和H3N2）显示出有效的长期保护效果。Hassan等同事构建了一种不同的活腺病毒载体疫苗，包含H5N1流感病毒的保守抗原表位，包括由M2外域（M2e）、血凝素（HA）融合域（HFD）、核蛋白的T细胞表位（TNP）和HA a-螺旋域（HaD）组成的多表位（ME）。这种腺病毒载体ME疫苗诱导了体液和细胞免疫应答，减少了接种小鼠肺部的流感病毒滴度，并显示出相对良好的免疫保护效果，能够抵抗H5、H7和H9流感病毒的挑战。然而，用Ad-ME载体疫苗免疫的小鼠在挑战后的肺部流感病毒滴度仍然显著高于匹配的HA对照疫苗接种动物，这表明最佳的抗体介导保护可能需要结构完整的HA免疫原。因此，还可以基于所谓的计算优化广谱反应原（COBRA）概念，计算设计表达结构完整、全长HA作为免疫原的其他类型的基于Ad的疫苗。目前，5型腺病毒（Ad5）是最常用的人腺病毒（AdV）载体。Wu等同事构建了一种复制缺陷的重组AdV（rAd5-avH1HA），在单轮细胞感染后能够表达H1N1流感病毒（A/swine/Zhejiang/199/2013株）的HA蛋白。作者表明，这种疫苗能够诱导产生高滴度的中和抗体，并显著减少接种的BALB/c小鼠鼻腔和肺部的挑战流感病毒的复制。由于大多数人对Ad5具有自然免疫力，非人源重组腺病毒载体，如牛腺病毒（BAdV），也越来越多地受到研究人员的关注。例如，Ekramy等同事使用BAdV-3构建了一种重组腺病毒载体流感疫苗BAd-H5HA，表达H5N1亚型禽流感病毒的HA基因，并在小鼠中比较了与HAdV类型C5（HAdV-C5）载体H5N1疫苗（HAd-H5HA）的免疫效果。他们首次发现，低剂量（1×106 PFU）肌肉注射BAd-H5HA可以在小鼠中诱导强烈的体液和细胞免疫应答，并提供针对异源H5N1病毒的有效免疫保护。相比之下，HAd-H5HA需要较高剂量（1×108 PFU）才能达到相当的免疫效果。 3.2.沙粒病毒载体流感疫苗沙粒病毒是一类具有双节段RNA基因组的包膜RNA病毒。沙粒病毒包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、拉沙病毒（LASV）、胡宁病毒（JUNV）、马丘波病毒（MACV）、皮钦德病毒（PICV）等。这些沙粒病毒（也称为哺乳动物沙粒病毒）可以通过感染啮齿动物的粪便、尿液、血液或唾液传播给人类，它们是沙粒病毒的自然宿主。由LASV、JUNV和MACV等致病性人类病毒引起的严重出血热是主要的感染相关症状。相反，许多其他沙粒病毒，如PICV，在感染后不引起人类和哺乳动物的任何临床表现，因此被认为是非致病性的（即无害的）偶然宿主。同样，LCMV通常不会对普通人群构成严重健康威胁，因为大多数LCMV感染的病例都是无症状或轻微的。先前的研究表明，沙粒病毒在感染的早期主要感染重要的免疫细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，这使它们成为疫苗开发的理想病毒载体，因为它们靶向这些能够自然增强对抗原蛋白免疫应答的抗原呈递细胞（APCs）。已有几项研究利用反向遗传技术生成携带感兴趣抗原蛋白的重组LCMV。Emonet等同事开发了一种三质粒反向遗传系统来生成三节段LCMV。通过该系统恢复的重组LCMV能够同时携带多达两个感兴趣的抗原蛋白的转基因。2018年6月，专注于肿瘤学和传染病创新活性免疫疗法的临床阶段生物技术公司Hookipa Biotech AG（“Hookipa”）和研究型生物制药公司Gilead Sciences, Inc.（“Gilead”）宣布了一项研究合作和许可协议，授予Gilead对Hookipa的TheraT®和Vaxwave®沙粒病毒载体技术的独家权利，用于乙型肝炎病毒（HBV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）两种主要慢性传染病的指示。值得注意的是，基于LCMV载体并表达人类乳头瘤病毒16型（HPV16）E7和E6开放阅读框（ORFs）的非致癌性融合蛋白作为模型肿瘤相关抗原的TheraT®载体，以及基于PICV的类似病毒结构，目前正在作为HPV16阳性头颈癌的重复原始增强免疫策略进入临床1期测试。这是首次在人类（FIH）第1期（剂量递增）/第2期（剂量扩展）多国、多中心、开放标签研究中包括140名HPV16+确诊癌症参与者。虽然这在使用LCMV等沙粒病毒载体作为治疗性肿瘤疫苗方面迈出了重要一步，但值得注意的是，约5%的人类人群显示出先前接触LCMV的证据，因此存在预先存在的（LCMV）载体免疫问题。此外，尽管大多数获得性LCMV感染是无症状或轻微的，但先天性LCMV感染可能非常严重，可能导致自然流产和胎儿死亡，或引起脑功能障碍。最近的报告还表明，LCMV感染免疫受损个体也可能导致一些严重的医疗并发症。在极少数情况下，LCMV感染可能导致某些形式的神经系统疾病，如无菌性脑炎、脑炎、脑膜炎或甚至在健康个体中引起小头畸形，因此必须谨慎使用。 PICV与LCMV具有相似的病毒基因组结构，但与全球发现的LCMV不同，其宿主是普通家鼠属Mus musculus。PICV仅在南美洲哥伦比亚的皮钦德谷特有的稻大鼠属oryzomys albigularis中发现。与LCMV不同的是，PICV在人类中不会引起疾病。Dhanwani等同事构建了一个PICV的三质粒反向遗传系统，并用它来开发PICV载体流感疫苗。当将A型流感病毒（HA和/或NP）的抗原蛋白转基因插入重组PICV载体疫苗（rP18tri）时，这些PICV载体流感疫苗可以有效地在接种的小鼠中诱导针对HA和NP的特异性体液和适应性免疫应答，并能提供持久的、有效的保护效果，使接种的动物能够抵御致命的小鼠适应株流感病毒（PR8）。此外，对PICV的中和抗体（nAb）反应水平非常低。这种免疫逃避现象部分可以用Pichinde病毒粒子表面膜上的糖蛋白（GPC）高度糖基化来解释，这使得病毒无法被nAbs识别。因此，PICV载体疫苗比LCMV载体疫苗具有一个主要优势，即PICV基疫苗可以克服初次加强免疫期间抗载体免疫的问题。尽管仍处于开发的早期阶段，但PICV载体已被证明相对安全，可以避免由于PICV仅在哥伦比亚自然发现而预先存在的免疫力，并且已显示出作为开发新型流感和其他病原体疫苗的病毒载体的巨大潜力。最近的一项研究表明，基于PICV和LCMV的病毒载体可以被设计来传递肿瘤相关抗原，如HPV16 E6和E7基因的非致癌性融合蛋白，在异源原始增强方案中可以有效诱导肿瘤特异性CTL（CD8+ T细胞）反应，消除已建立的实体肿瘤并保护接种的小鼠免受肿瘤再挑战。沙粒病毒家族成员可以诱导强烈的CTL反应和低水平的中和抗体，这有助于克服其他病毒载体中常见的抗载体免疫问题，例如痘病毒和腺病毒载体。基于这些激动人心的新发现，已经建立了一种新的基于沙粒病毒的免疫治疗策略。图3、不同类型病毒载体及其疫苗的优势、劣势以及应用。该图是用 Biorender（Biorender.com）创建的。 3.3.新城疫病毒载体流感疫苗新城疫病毒（NDV）是一种单股负链RNA病毒，属于副黏液病毒科，其基因组从3'端至5'端依次编码六个结构蛋白（NP、P、M、F、HN和L）。NDV基因组能够被改造以稳定表达大片段的感兴趣转基因（4.5 kb或更大），并且能够表达超过3种不同的非NDV蛋白。理论上，任何插入NDV两个蛋白编码序列之间的外源基因都可以被表达。先前研究表明，当外源基因插入NDV P和M基因之间时，表达水平最高。 NDV能够感染不同哺乳动物的呼吸道上皮细胞，如家禽、人类、猪、小鼠和非人灵长类动物（NHPs）。NDV能够激活宿主的局部粘膜免疫，诱导产生高效的体液和细胞免疫应答。此外，NDV的整个复制周期都在细胞质中进行，从而最小化了病毒基因组与宿主基因组之间重组的风险。NDV载体疫苗的应用可以通过喷雾和/或将疫苗加入饮水等大规模免疫方法进行。另一个优点是NDV在鸡胚中高效增殖，有利于重组NDV载体疫苗的大规模生产。因此，NDV载体已成为人类和动物疫苗开发的重要对象。人类不是NDV的自然宿主，因此NDV对人类不太致病。此外，已经证明NDV与已知的多种人类副黏液病毒（如呼吸道合胞病毒RSV和人类副流感病毒hPIV）的氨基酸同源性和相似性较低，因此人类对这些其他呼吸道病毒的免疫对NDV的影响有限。Bukreyev等同事构建了一种表达人类副流感病毒3型（HPIV3）HN蛋白的重组NDV，随后将其作为活病毒载体疫苗（106.5 PFU）用于非洲绿猴和恒河猴的鼻内和气管内接种。活重组NDV载体HPIV3疫苗仅在接种动物的呼吸道复制。28天后进行第二次免疫。结果显示，接受活重组NDV载体HPIV3疫苗免疫的动物的中和抗体血清滴度显著高于接受野生型HPIV3免疫的动物。为了评估NDV载体疫苗对人类流感病毒的有效性，Nakaya等同事使用NDV Hitchner B1株作为病毒载体，将人类流感A/WSN/33病毒的HA基因插入NDV P和M基因之间，构建了rNDV/B1-HA疫苗。结果表明，重组NDV载体流感疫苗能够在接种的小鼠中诱导产生强大的体液免疫应答，通过高水平的针对流感病毒HA蛋白的抗体滴度提供对A/WSN/33病毒的保护效果。DiNapoli等同事研究了NDV载体疫苗对非洲绿猴高致病性禽流感病毒（HPAIV）的免疫效果，他们用活重组NDV载体疫苗（10 PFU）表达H5N1 HPAIV HA蛋白（NDV-HA）对动物进行免疫。两次疫苗接种后，诱导产生了高滴度的中和抗体，并在呼吸道诱导产生了高水平的粘膜免疫球蛋白IgA反应。这些发现表明，NDV载体流感疫苗可能对人类使用具有潜力。新城疫和禽流感都是严重威胁家禽业的重要传染病。因此，通过疫苗接种预防这两种疾病具有特别的意义。构建高效的新城疫和禽流感二价疫苗可以减少疫苗生产成本和通过多种疫苗给动物带来的不利压力。NDV载体AIV疫苗是解决这一问题的策略之一。Ma等同事构建了一种表达A/chicken/Iowa/04-20/2015 (H5N2)病毒HA蛋白的重组NDV病毒，用作流感疫苗候选物。作者发现，无论是活NDV载体流感疫苗还是灭活NDV载体流感疫苗都能在接种后两周诱导产生针对H5N2 HA蛋白和NDVLaSota株的中和抗体。然而，活NDV载体流感疫苗的免疫原性低于灭活NDV载体流感疫苗。此外，这些疫苗对高致病性H5N2 A/turkey/Minnesota/9845-4/2015病毒的复制显示出效果，这通过接种动物的有限病毒脱落证明。免疫鸡的血清还能在病毒挑战后中和高致病性H5N1和H5N8病毒。在另一项研究中，Xu等同事将H9亚型AIV HA蛋白的外域与NDV F蛋白的跨膜域和细胞质尾区融合，构建了重组NDV载体流感rmNA-H9F疫苗候选物。接种后，这种疫苗能够保护鸡免受致死剂量的NDV和AIV H9N2的挑战，并诱导产生高水平的NDV-HI、H9-HI和分泌型IgA。尽管NDV载体AIV疫苗已经在实验室实验中显示出显著的积极免疫效果，但存在针对NDV的母源抗体可能会减少NDV载体疫苗的有益免疫效果。为了解决这个问题，一些研究小组建议使用嵌合NDV载体。通过用具有不同血清学特性的禽副黏液病毒2型（APMV-2）的对应物替换NDV F和HN蛋白的外域构建了嵌合NDV载体（NDV株BeaudetteC）。这绕过了针对NDV的预先存在的母源抗体，并为HPAI病毒提供了有效的保护。Chowdhury等同事也使用这种方法构建了表达H7 HA蛋白保守序列的重组嵌合NDV载体。他们的发现显示，由于母源抗体的影响，4周龄鸡在异源初次加强免疫策略后没有诱导出高滴度的NDV LaSota特异性抗体。然而，通过NDV/HA异源初次免疫后，H7中和抗体的滴度已经超过了16 HI，这可以保护肉鸡和火鸡免受H7N8 HAPI的侵害，同时也减少了病毒脱落。 3.4.杆状病毒载体流感疫苗杆状病毒是一种感染昆虫细胞的病毒，因此，只有无脊椎动物能被这种病毒感染。Autographa californica多重囊核多角体病毒（AcMNPV）是研究实验室中最常用的杆状病毒。AcMNPV是一种大型双链DNA病毒，基因组为133.9 kb，包含156个开放阅读框（ORFs）。AcMVPV的基因组较大，因此有足够的位置插入感兴趣的外源基因以在病毒感染的细胞中表达。在过去的三十年中，为了这个目的，杆状病毒表达载体系统（BEVS）不断优化。在过去的十年中，基于BEVS的疫苗研究逐渐增加，有7种商业化产品已获批准用于人类，其中包括人类乳头瘤病毒疫苗、流感疫苗、前列腺癌疫苗和脂蛋白脂酶缺陷疫苗。随着BEVS的不断进步，这些技术也被应用于构建杆状病毒载体流感疫苗。Influenza-Flublok Quadrivalent，一种四价重组杆状病毒载体流感疫苗，配方每0.5 mL剂量含有180 mg，每种流感病毒株的HA含量为45 mg：A/Hawaii/70/2019(H1N1)、A/Minnesota/41/2019（类似A/Hong Kong/45/2019的病毒）(H3N2)、B/Washington/02/2019和B/Phuket/3073/2013，可用于2020-2021年流感季节的人类疫苗接种。Flublok Quadrivalent是一种用于主动免疫以预防由甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的疾病的疫苗。它已于2017年获批用于18岁及以上人群。Influenza-Flublok的三价版本于2013年获得许可，但后来被四价版本取代。与灭活流感疫苗相比，Flublok配方中相对较高的流感抗原水平可以增强疫苗的免疫原性并减少局部反应原性。此外，Liu等同事评估了另一种基于BEVS的H5亚单位疫苗（A/goose/Guangdong/1/96），发现这种疫苗可以保护BALB/c小鼠以及无特定病原体（SPF）和商业肉鸡，因此可以作为人类和动物候选H5流感疫苗株。此外，Yu等同事使用BEVS构建了一种重组杆状病毒载体BmNPV-CMV/THB-P10/CTLT疫苗，该疫苗包含H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的T淋巴细胞表位（CTLT）的融合密码子优化序列，以及H1HA、H9HA和H7HA AIV亚型的Th和B细胞表位（THB）的融合密码子优化序列，然后用于小鼠和鸡的免疫。他们的发现表明，疫苗可以在两种动物中激活流感病毒特异性的体液和细胞反应，表明疫苗可以作为针对不同亚型AIV的通用疫苗。尽管BEVS具有作为疫苗开发有吸引力的载体平台的独特特性，但考虑到与BEVS相关的因素，如蛋白质复杂性、翻译后修饰、规模和成本，它并不适用于所有疫苗产品开发。应用杆状病毒载体疫苗作为常用疫苗载体平台的主要限制是缺乏人类免疫的安全指南。需要进一步研究以成功将技术整合到现实生活情况中。还需要在哺乳动物系统中建立完整的杆状病毒基因表达，以进一步增强基于杆状病毒的疫苗的安全性。杆状病毒可能是具有作为潜在疫苗的一些有吸引力属性的下一代流感疫苗。 3.5.疱疹病毒载体流感疫苗疱疹病毒是一种具有大型双链DNA基因组的病毒，大小范围约为125到240 kbp。这些疱疹病毒在宿主范围上受到限制，例如，禽类疱疹病毒只能感染禽类。有几种疱疹病毒载体可用，包括火鸡疱疹病毒（HVT）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）和鸡马立克氏病病毒（MDV）。MDV疫苗已经在养禽业中使用了40多年，因为它可以诱导对抗马立克氏病的终身免疫。HVT已被用作病毒载体来表达各种抗原蛋白，如AIV的HA蛋白和NDV的F蛋白。已有几种基于HVT载体的商业疫苗表达H5亚型AIV的HA蛋白，如Vectormune® AI [CEVA Animal Health, Lenexa, KS, USA (www.vectormune-ai.com)]。这种疫苗为火鸡和家鸭提供了针对H5亚型HPAI的有效免疫保护。Kapczynski等同事构建了一种表达2.2 H5N1 AIV HA蛋白的重组HVT载体AIV疫苗，该疫苗在鸡接种后对H5N1和H5N2 HPAIV挑战产生了显著的保护效果，使动物的存活率达到80%-95%。此外，接种HVT载体AI疫苗的鸡的脾T淋巴细胞能够识别MHC匹配的目标细胞感染H5、H6、H7或H9 AI病毒。Li等同事使用细菌人工染色体（BAC）克隆技术构建了另一种表达H7N1 HPAIV HA基因（rHVT-H7HA）的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H7HA可以诱导产生H7特异性免疫反应，帮助鸡抵御高致病性H7N1病毒的感染，并显著减少病毒脱落。Liu等同事还使用BAC克隆技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了一种表达H9 HA蛋白的重组HVT载体疫苗。接种rHVT-H9可以在接种后35天诱导鸡产生体液和细胞免疫反应，这通过针对H9的高滴度中和抗体HI和激活IFN-g+ CD4+和IFN-g+ CD8+ T细胞证明。当接种的动物在接种后35天受到H9N2 AIV挑战时，在鸡的气管和肛门拭子中在挑战后3天和5天没有观察到病毒脱落。此外，在接种鸡的器官（气管、肺、脾和肾）中没有检测到H9N2病毒。这些发现表明，HVT作为禽流感疫苗开发的病毒载体具有前景。然而，疱疹病毒载体的一些缺点，如高水平的预先存在的抗载体免疫、通过卵内途径提供完全保护所需的相对较长时间以及宿主细胞终身感染可能造成的风险，可能会阻碍这种病毒载体在疫苗开发中的考虑。流感疫苗的开发包括季节性流感疫苗和通用流感疫苗两个主要方向。季节性流感疫苗针对每年流行的流感病毒株进行设计，而通用流感疫苗则旨在提供针对多种流感病毒株的广泛保护。 4.季节性流感疫苗和通用流感疫苗的开发许多前述的病毒载体疫苗已被证明是安全且具有免疫原性的，它们能够激活针对感兴趣抗原蛋白的体液和细胞免疫反应，无论是在局部粘膜部位还是系统性地。因此，病毒载体疫苗可以克服传统灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗的一些固有缺点。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需要进一步研究。流感疫苗开发中真正的挑战是如何应对流感病毒频繁的抗原漂移和抗原转变，以及流感病毒的快速突变率。为了克服这个问题，最近的努力集中在改进流感病毒的流行预测，以开发能够与预测的季节性病毒紧密匹配的疫苗候选物，以及开发能够对多种流感病毒株提供广泛保护效果的通用流感疫苗。 4.1.季节性流感疫苗的开发流感监测是一项全球性的公共卫生活动，每年在全球范围内进行。世界卫生组织（WHO）自1952年起组织了这一协调的全球性努力，以追踪流感病毒感染，最初称为全球流感监测网络（GISN），2011年更名为全球流感监测与响应系统（GISRS），并扩展到包括113个成员国的143个机构。根据这一流感病毒监测系统的主要两种方法，通过综合征监测系统从门诊或医院收集信息，以监测当地社区流感疾病的新出现，而循环流感病毒株的病毒学特征则由实验室监测系统收集。每年两次，全球季节性流感病毒循环的所有收集到的信息都会被GISRS整合、分析，并提供给适当的当局，用于季节性流感疫苗株的选择和通用流感疫苗的开发。自20世纪50年代以来的几十年里，流感病毒疫苗株的选择依赖于年度血清学检测的数据，这些数据提供了免疫系统对当前循环流感病毒的反应的表型测量。然而，血清学检测有一定的缺点，包括劳动强度大、实验室间数据不一致，以及数据不公开和/或难以解释或扩大规模。因此，这些方法只能应用于分析一小部分流感病毒。因此，迫切需要开发基于监测数据的流感病毒持续进化分析工具，并为选择具有更广泛保护潜力的流感疫苗株提供建议。系统发育树或进化树是用于可视化循环流感病毒遗传进化的工具之一。多年来，研究人员开发了多个类似的工具来生成系统发育树并分析循环流感病毒的遗传进化。其中一种方法称为Nextflu（https://bedford.io/projects/nextflu/），这是一个由Neher和Bedford设计的在线可视化工具。Nextflu可以实时跟踪循环流感病毒的进化，特别是人类季节性流感病毒的进化。用户可以通过可视化循环流感病毒株的遗传和流行病学特征来分析季节性流感循环模式，这可以为即将到来的流感季节提供预测。同样，人群水平流感病毒序列的AD图结合了系统发育推断和祖先特征状态重建的信息，这是一种依赖于使用最大简约法将生物体的特征状态映射到系统发育树上的方法，以识别可能处于定向选择下的等位基因和相关遗传变化。除了系统发育树，抗原图或抗原图也是重要的分析工具。抗原图已经使用A型（H3N2）人类流感病毒的数据开发，并常规用于分析WHO流感监测网络的全球数据，作为流感疫苗株选择过程的一部分。抗原图基于反映病原体抗原特性的血清学数据。流感病毒的抗原特性通常基于对病毒分离物进行的血凝抑制（HI）数据，这些数据针对特定株的感染后雪貂抗血清进行测试。通过使用上述工具可视化流感病毒的自然进化，研究人员可以构建统计学习模型来解释抗原差异并预测流感病毒的下一步进化。例如，Steinbrück及其同事结合AD图和抗原树分析了2002年至2007年收集的流感A型（H3N2）的HA基因的进化，并成功预测了H3N2病毒在回顾性测试场景中的抗原进化。尽管能够预测下一个季节性流感病毒株，但通常需要大约一年的时间来完成流感疫苗株的选择，并通过疫苗生产、发布和分发过程。然而，在这段时间里，循环的流感病毒可能会进一步变异，使其与选定的疫苗株不相似，正如最近的例子所示，预测的H3N2病毒流感疫苗，这种病毒与其他季节性流感病毒相比，进化得特别快且不可预测，并在2004年至2019年过去十五个流感季节中的六个季节中，使季节性流感疫苗与自然循环的H3N2株不匹配。此外，季节性流感疫苗刺激的抗体水平可能只能在相对较短的时间内维持，然后在流感季节结束前降至亚保护水平。这些问题可能会使预测和生产最佳季节性流感疫苗的能力复杂化，因此可能需要其他方法（例如，通用流感疫苗的开发）来生产覆盖不同流感病毒株的更广泛流感疫苗。 4.2.通用流感疫苗的开发通用流感疫苗旨在提供针对甲型和乙型流感病毒的保护，而不受它们已知的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）或其他病毒基因或基因片段的抗原漂移和移位的影响。目前，通用流感疫苗开发的几种常见靶点包括HA蛋白的保守茎部结构域、M2离子通道（M2e）的外域以及内部蛋白核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）。由于流感病毒的茎部区域位于病毒粒子表面的一个不易被中和抗体接近的区域，因此它受到宿主免疫系统的选择压力较小，因此在不同流感病毒之间高度保守。因此，针对HA蛋白的这个保守茎部区域，可以合理地假设能够诱导出针对流感病毒内部亚型、不同亚型之间以及不同群组之间的广泛反应性抗体。已经探索了包括生成具有HA头部高度糖基化、"无头"HA、仅表达茎部的长α螺旋（LAH）结构域以及开发嵌合和马赛克HA以诱导针对茎部的抗体等不同策略的候选通用流感疫苗。通过这些策略开发的一些通用流感疫苗已进入人体临床试验，并显示出一些令人鼓舞的结果。例如，一项包括65名参与者的I期临床试验结果表明，他们接受了两次不同组合的嵌合HA活流感病毒、灭活流感病毒或灭活流感病毒加佐剂的免疫接种，显示出诱导抗茎部H1抗体的证据。更令人鼓舞的是，结果显示，在接受了两次嵌合HA灭活和佐剂流感病毒疫苗的参与者中，诱导的抗茎部抗体在1.5年内比基线高出4倍以上。其他尝试生产通用流感疫苗的方法涉及以流感病毒M2e蛋白为靶点。虽然由流感病毒M2e蛋白诱导的特异性中和抗体可以通过补体或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性与感染病毒的宿主细胞上的M2e结合，但一些研究表明，接种个体中M2e特异性血清抗体滴度迅速下降。这种弱抗原免疫原性的例子，再加上大多数诱导的抗体是非中和抗体，突出了通用流感疫苗开发过程中的一些挑战。因此，建议通过研究更保守的流感病毒抗原（或某些病毒抗原的保守区域）与使用适当的佐剂和其他增强抗原免疫原性的方法相结合，以及/或研究将通用流感疫苗与其他已知疫苗联合使用，这些方法可能有助于增强产生针对不同流感病毒株的更持久和广泛保护性的HA/NA中和抗体的潜力。通用流感疫苗的开发是一个复杂的过程，需要综合考虑病毒的保守抗原、疫苗设计策略、佐剂的选择以及免疫程序的优化等多个方面。随着对流感病毒以及宿主免疫应答机制的深入了解，未来有望开发出能够提供广泛保护的通用流感疫苗。 5.重组流感病毒作为疫苗载体的开发反向遗传系统可用于实验室中生成重组流感病毒，这是将其作为疫苗载体的基础。流感病毒(IAV)感染可以诱导CD4+和CD8+ T细胞产生细胞因子，这些细胞因子进而促使CD4+ T细胞分化为Th1或Th2细胞。Th1细胞参与CD8+细胞毒性T细胞介导的免疫应答，识别并破坏病毒感染细胞，抑制病毒复制和增殖。另一方面，Th2细胞可以激活B细胞，促进中和抗体的产生，从而参与宿主的体液免疫。减毒活流感疫苗(LAIV)在感染早期也能诱导粘膜免疫。近年来，重组流感病毒已被用作病毒载体。将外源基因以不同的克隆策略插入流感病毒基因组，可能会产生不同的免疫应答。例如，一些研究表明，当外源基因插入流感病毒HA或NA的基因片段时，重组流感病毒载体疫苗能够介导针对外来蛋白的强烈中和抗体应答。相反，将外源基因插入流感病毒内部蛋白（例如NP和M1）或编码核糖核蛋白（例如PB2、PB1和PA）的基因片段，可以诱导针对外来蛋白的CD8+ T细胞应答。图4、研发针对流感病毒血凝素（HA）茎部的通用流感疫苗的策略：超糖基化HA、无头HA、长α螺旋（LAF）片段、嵌合HA和马赛克HA。该图是用 Biorender.com 创建的。基于这些发现，Isakova-Sivak等同事构建了两种重组活流感病毒载体腺病毒疫苗(LAIV-AdV)，通过将AdV的T细胞表位插入授权的冷适应H7N9 LAIV病毒的全长NA基因和截短的NS1基因的ORF中。使用这种LAIV-AdV疫苗免疫，可在C57BL/6J小鼠中诱导相对较强的流感病毒特异性抗体和细胞介导的免疫，足以保护接种动物免受致病性H7N9流感病毒和人AdV5感染。此外，Matyushenko等同事构建了两种重组LAIV载体疫苗，通过将编码RSV M2蛋白T细胞表位的基因插入H7N9亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)或非结构蛋白(NS1)中。这两种重组LAIV载体疫苗都能同时保护小鼠免受流感病毒和RSV感染，并在接种和挑战动物的肺部及肺组织驻留记忆T细胞(TRM)亚群中激活流感和RSV特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。尽管取得了这些积极的结果，重组流感病毒载体疫苗的安全性和有效性仍需进一步研究和改进。作为减毒活流感病毒，当用作病毒载体时，它仍能复制，因此存在与流通的野生型流感病毒发生基因重组和重配的可能性。此外，当病毒载体疫苗在实验室或接种个体中连续传代时，可能会丢失外源基因。 6.结语许多病毒载体流感疫苗已被证明是安全和具有免疫原性的，能够激活针对局部粘膜位点或系统性抗原蛋白的体液和细胞免疫应答。这些病毒载体流感疫苗因此可以克服传统流感亚单位疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗的一些固有缺点。到目前为止，已经研究了许多病毒载体流感疫苗，其中一些显示出可接受的有效性水平。这些新型病毒平台和技术为人类、家畜以及伴侣和外来动物的许多疾病提供了快速、高效和成本效益的疫苗生产方式。然而，这些疫苗的长期有效性和安全性仍需进一步研究。流感疫苗开发中的一个真正挑战是如何应对频繁的抗原漂移和移位，以及这些病毒的快速变异率。解决这一棘手但重要问题的潜在解决方案是通过优化预测下一种主要流感病毒株的方法，以便开发出具有最大保护价值的更好的季节性疫苗，和/或通过开发仍在深入研究和开发阶段的通用流感疫苗。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

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