AM14

摘要：呼吸道合胞病毒（RSV）仍然是导致5岁以下儿童和65岁以上成人住院和死亡的主要原因。RSV对全球的影响使得寻找RSV疫苗成为优先事项，大多数研究都针对关键的融合（F）蛋白。然而，关于RSV进入宿主细胞的机制以及RSV F蛋白触发和促进融合的过程仍存在疑问。这篇综述强调了这些问题，特别是围绕F蛋白内部一个被切割的27个氨基酸长的肽段，即p27。 1.呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白：切割位点和p27肽段 呼吸道合胞病毒（RSV）仍然是导致5岁以下儿童和65岁以上成人住院和死亡的主要原因。RSV是一种包膜的、单链、负义RNA病毒，属于肺病毒科。与副黏病毒类似，肺病毒由核蛋白复合体（一个包裹遗传物质的核蛋白（N）、聚合酶（L）和聚合酶辅助因子P（磷酸蛋白））、连接核蛋白复合体与磷脂包膜的基质（M）蛋白层，以及三种跨膜糖蛋白组成。融合蛋白（F）和附着（G）糖蛋白促进膜融合和病毒进入。功能性和结构研究表明，肺病毒小疏水（SH）蛋白形成pH依赖性病毒孔蛋白，调节膜通透性、感染力，并防止宿主细胞凋亡。RSV F作为不活跃的前体（F0）合成，通过宿主细胞蛋白酶切割产生两个二硫键连接的亚基，F1和F2，它们具有融合能力。活跃的F蛋白处于一种亚稳态的“前融合”状态，直到触发事件诱导构象变化，暴露融合肽，插入目标膜，随后形成六螺旋束，推测这将推动膜融合。这一过程对所有副黏病毒和肺病毒都是相似的；然而，RSV F有几个差异尚待完全理解。Collins等人（1984年）和Elango等人（1985年）首次对RSV F进行了测序，显示它由574个氨基酸组成，具有一个多碱基序列（KKRKRR136），对应于furin共识位点。与密切相关的副黏病毒F蛋白不同，多碱基序列为六个氨基酸长，导致Bolt等人提出其他蛋白酶可能参与切割（例如前蛋白转化酶5和7）并激活RSV F。然而，直到2001年，González-Reyes等人（2001年）和Zimmer等人（2001a）独立证明RSV F在两个多碱基位点（RARR109和KKRKRR136）被切割，产生两个主要亚基：F2亚基（20 kDa，AA 26至109）和F1（50 kDa，AA 137至574），并释放一个内部27个氨基酸的肽段，称为p27（AA 110-136）（图1A）。切割后这个片段的命运仍然未知。 图1 RSV F蛋白在前融合和后融合构象中的结构。(A) 一级结构显示了F1和F2亚基（细线）之间的二硫键，N-糖基化位点（▽），以及F1 N端的融合肽（FP）；p27肽段显示在R109和R136切割位点之间（箭头）。在(B) 前融合和(D) 后融合构象中的F蛋白三聚体，N-糖基化位点N27、N70和N500被建模为棒状。前融合(C)和后融合(E)构象中的F1+F2原体。在病毒进入过程中，前融合三聚体(B)经历结构重排，形成最终的后融合构象(D)。FP（F1 N端）、β3/β4发夹和α2、α3和α4螺旋重新排列，与α5（C）融合形成延伸的后融合螺旋α5post（E）；前融合β22平行链解开，以便α10螺旋（C）可以与α5post相遇，完成最终的后融合构象（E）。尽管在晶体结构中未显示，但当部分切割时，p27肽段仍然位于F1 N端，封闭融合肽，这阻碍了融合效率。根据McLellan等人（2013b年）。RSV融合糖蛋白三聚体的结构，结合于前融合特异性中和抗体。《科学》杂志（80-）340:1113–1117。经AAAS许可转载。 通过牛呼吸道合胞病毒（BRSV）的位点定向突变，Zimmer等人确定furin在R109位点的切割损害但并未完全消除体外融合活性，突出了R136位点切割的重要性，这暴露了F1亚基N端的融合肽。Rawling等人生成了仙台病毒（SeV）融合的嵌合突变体，包括一个或两个RSV furin识别位点，而不是SeV F中通常的单一切割位点。SeV F通常需要HN附着蛋白来触发融合，而RSV F可以在没有G蛋白的情况下在细胞培养中促进融合。有趣的是，所有SeV F/RSV切割位点嵌合突变体在没有HN蛋白的情况下形成了合胞体，表明RSV F在没有附着蛋白的情况下融合的能力，至少部分是由额外的切割位点促进的。已知有两种RSV亚型，A型和B型，根据与RSV/A Long株（历史上用于体外研究和疫苗开发的原型株）的抗原轮廓差异进行分类。Hause等人（2017年）比较了1000多个RSV A型和B型序列与RSV/A Long的序列变异性，表明尽管F蛋白在RSV基因型中高度保守，但RSV/B株的p27区域的非同义氨基酸变化显著多于RSV/A株。然而，熵分析——每个氨基酸位置的变异性测量——揭示了在同一亚型内，RSV/As的p27序列中的几个氨基酸位置的变异性比RSV/Bs更大。正如Rajan等人（2022年）所报告的，RSV感染HEp-2或A549细胞（通常用于体外研究）在感染RSV/A或B时具有不同的病毒生长动力学和宿主反应。此外，p27的切割效率显示出细胞系依赖性，因为在RSV感染的HEp-2细胞表面发现了更高水平的成熟F蛋白保留p27，与RSV亚型无关。另一方面，p27的切割也取决于亚型，因为与感染RSV/B的细胞表面表达的F蛋白相比，RSV/A的F蛋白切割效率较低（保留更多p27）。此外，作者表明对于两种亚型，p27的切割效率随时间下降。这些研究强调，尽管RSV亚型和基因型之间F蛋白序列高度保守，但p27的切割依赖于宿主因素（例如，酶周转、囊泡运输、翻译后修饰和先天免疫）而不仅仅是切割位点的酶学可及性。 2.p27糖基化位点的见解 糖基化是一种关键的翻译后修饰，因为它影响结构、功能、稳定性和向细胞表面的转运。RSV F具有五个N-糖基化位点，在亚型间高度保守（N27、N70、N116、N126和N500）；某些株系还有一个额外的N120糖基化位点。两个，对于某些株系是三个糖基化位点位于p27段内（N116、N120和N126；图1A）。Zimmer等人（2001b年）和Leemans等人（2018年）使用系统性N-Q突变表明，p27段的糖基化不影响F蛋白的切割或向细胞表面的转运。此外，含有突变N116Q或N126Q的F蛋白与野生型相比没有显示出分子量差异。因此，Leemans等人得出结论，p27在成熟F蛋白中被完全切割掉。两个研究小组都观察到，转染突变体N116Q的BSR T7/5细胞中形成了较大的合胞体。病毒蛋白可以使用糖基化来屏蔽抗原位点，逃避抗体识别；然而，Leemans等人证明，p27在N116和N126的糖基化并没有显著影响Palivizumab或其他针对前融合构象的中和抗体的结合。Leemans等人（2019年）将相同的突变纳入重组病毒。在感染HEp-2细胞期间，编码突变N116Q或N126Q的病毒表达的F蛋白的分子量与野生型病毒的F相当。然而，与野生型RSV相比，感染突变体病毒RSV F N116Q的合胞体形成减少。尽管未确认糖基化p27的存在，但体外和体内的合胞体形态变化表明，p27上至少一个位点的糖基化可能在RSV生物学中具有重要作用。 3.p27对RSV进入的影响 细胞表面的RSV F通常被认为是被切割和具有融合活性的。在RSV感染模型中，无法检测到F0在细胞表面的存在。然而，最近有报道称p27存在于感染细胞的细胞表面，这表明未切割或部分切割的F可能存在于细胞表面。Krzyzaniak等人（2013年）也提出RSV F以部分切割的状态存在于病毒表面（图2）。他们通过液相色谱与质谱联用（LC/MS）分析，在纯化的RSV/A颗粒上检测到对应于p27区域的肽段。对感染HeLa细胞的西方印迹分析与在病毒组装前在R109位点发生切割一致，而在病毒进入后通过病毒微囊泡吞噬作用后仅在R136位点发生切割。然而，与密切相关的人类偏肺病毒（HMPV）不同，RSV融合不依赖于pH值，表明内体酸化可能不是F切割和因此RSV进入所必需的。两个切割事件何时发生的问题一直存在争议，需要进一步的研究来澄清不同的研究结果。 图2 两种提议的RSV进入机制。(A) 在巨胞吞饮进入方式中，F仅在高尔基体转运途中的FCS1处被切割，以半切割状态表达在病毒表面。新合成的病毒通过巨胞饮作用进入宿主细胞，允许FCS2在内体内的溶酶体L中被切割。这激活了F，促进与内体膜的融合，并将病毒遗传物质释放到宿主细胞质中。(B) 在直接血浆膜进入方式中，F通过分泌途径转运，在FCS1和FCS2处都被furin切割，以完全切割状态表达在病毒表面。通过受体结合发生进入，导致病毒和宿主细胞膜的融合，由F促进。 4.p27对F蛋白三聚体影响的见解  具有融合能力的RSV F由三个二硫键连接的F1和F2原体通过非共价相互作用形成（图1B-E）。Gilman等人在2015年鉴定了一种识别切割后的三聚体前融合F的RSV中和抗体AM14。AM14的结合依赖于furin切割，要么是因为p27通过空间抑制干扰AM14的结合，要么是因为F在切割前无法三聚体化。同年，Krarup等人的一项研究确定p27使蛋白三聚体不稳定。在室温下将可溶性F蛋白在0.1% SDS中孵育时，不含p27的三聚体中有50%被单体化，而含p27的三聚体中有97%被单体化。 Gilman等人使用特异性抗体评估了三聚体化F的稳定性，该抗体特异性针对可溶性的前融合F三聚体。细胞表面的F1+F2异源二聚体三聚体存在于关联-解离三聚体的动态平衡中，这表明三聚体化存在一种“呼吸”机制。 5.p27对F蛋白结构的影响  RSV F四聚体结构的首个证据研究是在2000年，当时Calder等人使用电子显微镜显示RSV/A Long株的F蛋白三聚体聚集成蔷薇状结构，呈锥形或棒棒糖状棒。将RSV F蛋白与副流感3型和5型（PIV3和PIV5）F蛋白结构进行形态比较表明，锥形三聚体可能对应于前融合F（触发前），而棒棒糖形三聚体对应于后融合F（触发后）蛋白。 Gozáles-Reyes等人和Ruiz-Argüello等人报告说，F0的完全酶促切割（释放p27）或仅在R136处的部分切割（p27未从F2切割）导致蔷薇状结构的形成，以及从锥形到棒棒糖形结构的形态变化。然而，Chaiwatpongsakorn等人表达RSV/A D53株的F蛋白三聚体时发现，p27的切割并不是形态变化的驱动因素，而是热力学和物理化学因素（例如，温度和低摩尔浓度）是触发因素。 在2011年，McLellan等人和Swanson等人独立确定了RSV/A A2株F蛋白后融合构象的晶体结构。两个构建体都截断了融合肽的初始部分，以最小化聚集，同时保持furin切割位点完整。与副流感病毒类似，后融合F单体的柄部分由F1亚基的N-和C-末端形成的两个反平行螺旋组成，将融合肽和跨膜区域并置。棒棒糖形后融合F的柄由六个α-螺旋束组成，形成一个热力学稳定的结构。后融合结构中缺少p27归因于蛋白合成过程中两个furin位点的完全切割（图1）。 在2012年，Smith等人报告了基于RSV/A A2株的近全长F蛋白的表达和纯化，通过突变furin切割位点R136（从KKRKRR136突变为KKQKQQ136，仅在R109处切割F0）和删除F1亚基N末端的前十个氨基酸进行优化。该构建体产生了针对前融合和后融合RSV结构特异的抗原位点的抗体，包括与Palivizumab共享相同抗原位点的抗体。 McLellan等人在2013年首次发表了RSV F前融合构象的部分结构，通过与前融合特异性D25抗体共晶与RSV/A A2株的近野生型F蛋白。同年，该研究小组发表了不与单克隆抗体共晶的前融合构建体的结构，命名为DS-Cav1。前融合单体结构紧凑，由两个叶（一个靠近病毒膜，一个远离病毒膜）通过两个平行β-链（一个来自F1，一个来自F2）连接，由几个单体间接触稳定。邻近单体的膜近叶稳定了F1亚基N末端的高度疏水的融合肽。在2015年，Krarup等人的突变分析得出了一个模型，其中p27切割是允许三聚体化和融合肽埋藏在疏水腔中所必需的。 RSV F三聚体从前融合到后融合的构象变化需要剧烈的重排，这导致Gilman等人研究了F在溶液中和脂质膜上的动态。他们观察到前融合三聚体在呼吸样运动中在离散的开放和闭合状态之间交替，类似于HIV Env蛋白，并且在表达全长RSV F蛋白的细胞表面观察到相同的动态。此外，在转染野生型RSV F蛋白或携带Foldon三聚体化基序的F变体的永生化细胞系表面，作者得出结论，F蛋白在细胞膜上自然存在于单体和三聚体之间的平衡状态。 到目前为止，还没有结构确定方法能够表征F蛋白最灵活的区域（跨膜域、细胞质段和p27肽段）。然而，在2021年，Krueger等人使用小角中子散射和小角X射线散射技术（SANS和SAXS），确定了基于Polysorbate 80纳米颗粒的prefusogenic F的四聚体结构，并在三聚体结构内模拟了这些区域的定位。在纳米颗粒上配方时，三聚体prefusogenic F被特异性单克隆抗体识别，这些抗体针对前融合或后融合排列。最重要的是，保留部分切割的p27的prefusogenic F表明，p27的灵活性并未破坏F蛋白三聚体排列的稳定性。此外，显示部分切割原体的F蛋白三聚体的RSV感染细胞在前融合构象上显示出更高水平的表面F蛋白；可检测到p27的F蛋白三聚体比完全切割的F蛋白原体组成的三聚体更热稳定，尽管需要更多的研究来评估p27对RSV感染力和复制周期的影响。 根据Krueger等人的说法，在前融合结构中，F1亚基N末端的p27将暴露于溶剂中，这支持了Krarup的观察结果，即融合肽+p27无法适应前融合结构内形成的腔室。另一方面，部分切割的RSV F蛋白可以在没有Foldon三聚体化基序的帮助下形成三聚体。 6.自然感染期间对p27的体液和粘膜免疫反应  在2016年，Fuentes等人发表了第一份报告，证明了在自然RSV感染期间对p27的免疫反应。研究者们观察了五名婴儿在首次RSV感染前后的血清，使用全基因组-噬菌体展示库（GFPDL）鉴定了新的抗原位点，这些噬菌体展示库编码覆盖F全长的肽段。一个新的抗原位点映射到p27。然后，作者合成了覆盖p27区域的肽段，并使用表面等离子共振（SPR）技术调查了来自儿童（<2岁）、青少年（10-14岁）和成人（30-45岁）的血清样本。尽管在所有年龄组中都发现了结合p27的抗体，但儿童的反应性高于青少年，成人最低。作者提出对p27的免疫反应来自于未切割的F0前体，在不成熟的病毒粒子和垂死的感染细胞中存在。基于Tapia等人的工作，p27区域高突变率引起的免疫压力可能是对p27高抗体反应的驱动因素。 在RSV感染的造血细胞移植（HCT）受者中发现了对p27的体液和粘膜免疫。Fuentes等人再次使用GFPDL和SPR检查了11名感染RSV/A的HCT患者的血液血清和鼻腔冲洗液，这些患者病毒脱落少于14天（早期恢复）或超过14天（晚期恢复）。两组都产生了识别p27的抗体。然而，早期恢复的患者产生的粘膜抗体与p27的结合高于晚期恢复的患者。 Leemans等人评估了对缺乏N116或N126糖基化的重组F蛋白的免疫反应。用编码F N116Q的质粒免疫的BALB/c小鼠产生了比对照组更强的中和抗体反应。用带有N116Q突变的重组感染性RSV免疫BALB/c小鼠，产生了比野生型RSV F病毒更高的中和抗体滴度。 Ye等人量化了33名HCT患者在RSV感染期间（急性）和感染后（恢复期）的血清和鼻腔冲洗液中IgG、IgA和类似p27抗体（P27LA，能够与单克隆抗p27竞争的天然抗体）的数量。血清和鼻腔冲洗样本中抗p27 IgG和IgA的浓度大约比其他F特异性位点低1000倍。P27LA也显示出比免疫相关性PCA（Palivizumab竞争性抗体）低1000倍的浓度水平。抗p27抗体似乎并没有提高针对RSV的整体中和抗体活性。然而，恢复期HCT患者鼻腔冲洗样本中抗体浓度的降低表明粘膜抗p27抗体可能与释放的病毒或病毒感染的上皮细胞结合，有助于控制呼吸道的感染。 在2019年，Patel等人证明，纳米颗粒配方的前融合F蛋白被前F特异性单克隆抗体（抗原位点Ø和VIII - 也称为V）以及针对前F和后F构象共享的抗原位点（位点II和IV）的单克隆抗体所识别。前融合F蛋白还在挑战棉鼠模型中诱导了显著水平的功能中和抗体和竞争性抗体，以抗原位点Ø、VIII、II、IV和p27，预防肺部病毒复制，无显著组织病理学变化。前融合纳米颗粒配方进一步开发成疫苗候选物，用于孕产妇免疫，诱导强烈的、广泛的抗体反应和中和抗体活性。这是第一个针对通过在晚孕期接种孕妇来保护新生儿的RSV疫苗候选物，显示了有效的抗体经胎盘转移。 Blunck等人（2022年）报告了在2018-2019年RSV季节期间，65岁以下健康成年人对p27的免疫反应动力学，这些成年人自然感染了RSV/A或RSV/B。19名受试者根据中和抗体滴度水平被分为未感染、急性感染和最近感染的个体。正如在HCT患者中观察到的，所有受试者都呈现可检测的抗p27 IgG和IgA水平。在整个研究过程中，未感染个体维持恒定的血清IgG抗p27水平，而急性感染和最近感染的个体分别经历了抗p27抗体的增加和减少。然而，在这个健康成年人队列中，p27并不是免疫优势表位。 7.在体外和体内的p27：首次在感染细胞表面和组织病理学切片上检测到p27的证据  为了更好地了解F内保护性抗原位点，Lee等人（2022年）化学合成了跨越整个F蛋白的肽段。用这些肽段免疫的BALB/c小鼠通过鼻内挑战RSV/A A2株。在挑战后5天，与模拟免疫小鼠相比，免疫p27区域的小鼠的肺病毒滴度和病理评分显著降低，这表明p27可能引发保护性免疫反应；然而，保护作用不太可能是由于中和抗体活性。作者反而推测p27可能诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和T细胞介导的效应功能。 此外，用抗F-p27抗血清免疫染色的肺组织显示了感染后p27表面表达。与RSV/A A2感染的A549细胞显示出可比的表面染色，证实了体外p27表面表达。作者将这归因于感染细胞表面F0的表达，与2013年Krzyzaniak等人（2013年）看到的结果一致。然而，其他研究已经确定F0在到达细胞表面方面效率低下或无法到达。关于p27如何在细胞表面表达的机制理解尚未揭开。 8.知识空白和未来方向  在过去20年中，电子显微镜、晶体学和结构建模的重要工作增加了我们对RSV F蛋白结构的理解；然而，p27的生物学角色和命运仍然难以捉摸。 p27的切割不是细胞转运的要求，因为F蛋白可以在细胞表面以未切割、部分切割和完全切割的F蛋白的异质群体存在。然而，目前尚不清楚完全切割的p27是否作为游离肽分泌，或者它是否具有改善病毒适应性的细胞内角色。此外，尽管F蛋白序列在RSV亚型和基因型之间高度保守，但p27区域是可变的；因此，解决这些序列差异的未来研究可能会阐明F蛋白结构、进入机制和感染力。 目前尚不清楚F蛋白的完全切割是否需要F1+F2异源二聚体的三聚体化，尽管人们接受部分切割的p27在F蛋白腔内会破坏三聚体化。另一方面，“呼吸”运动的F蛋白三聚体和前融合F三聚体模型表明，RSV F蛋白可能在携带部分切割的p27的同时三聚体化。 虽然免疫学数据显示p27在所有年龄段的RSV感染个体中引发血清抗体反应，但抗p27 IgG抗体的中和活性不佳提出了保护可能来自ADCC或其他细胞介导的免疫机制的可能性，这值得进一步调查。同样，粘膜抗p27 IgA抗体在病毒清除中的作用需要额外的研究。最后，对p27的体液和粘膜免疫反应可能是RSV感染的潜在强大的生物标志物。